条锈病对小麦籽粒APX和GR基因表达和酶活性的影响

常玉珍 高红云 史银佩 王言景 吴玉芳 蒋沙沙

摘要 [目的]揭示小麦对条锈病的抗性应答机制。[方法]以田间优势条锈菌接种抗病小麦品种赛德麦601和感病小麦品种郑麦379，采用实时荧光定量PCR技术和分光光度计法分析小麦籽粒中抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）的基因表达和酶活性变化。[结果]花后15 d，郑麦379中APX和GR基因表达显著升高，APX基因表达量升高幅度大，花后25 d上调至CK的11.45倍，且持续时间较长;GR短时间小幅度升高，在花后20 d升高至CK的1.65倍。赛德麦601中APX基因仅在花后20 d后表达量显著升高，上调至CK的9.83倍，其他时期变化幅度很小;GR基因仅在花后25 d和花后30 d表达量显著升高，分别升高至CK的2.09、1.92倍。APX和GR酶活性的变化与基因表达量的变化一致。[结论]APX和GR参与了小麦对条锈菌的抗性应答反应。

关键词 小麦条锈菌;抗坏血酸过氧化物酶;谷胱甘肽还原酶;酶活;基因表达

中图分类号 S-435.121.4+2  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）13-0108-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.026

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Stripe Rust on Gene Expression and Enzyme Activity of APX and GR in Wheat Grains

CHANG Yu zhen， GAO Hong yun， SHI Yin pei et al

（College of Life Science， Zhengzhou Normal University， Zhengzhou， Henan 450044）

Abstract [Objective]In order to reveal the mechanism of wheat resistance to rust.[Method]The changes of gene ex pression and enzyme activity of ascorbate peroxidase （APX） and glutathione reductase （GR） in wheat grains were analyzed by real time quantitative PCR and spectrophotometry after inoculating resistant wheat Saidemai 601 and susceptible wheat Zhengmai 379 with dominant stripe rust in the field.[Result]The results showed that the expression of APX and GR genes in susceptible cultivar Zhengmai 379 increased significantly at 15 days after anthesis （DAA）， and the expression of APX gene increased significantly to 11.45 times of the control at 25 DAA and lasted for a long time.And GR expression increased to 1.65 times of the control at 20 DAA.The expression of APX gene in resistant cultivar Saidemai 601 increased significantly at 20 DAA to 9.83 times  of the control;the expression of GR gene increased significantly only at 25 and 30 DAA， and reached 2.09 and 1.92 times of the control， respectively.The changes of APX and GR activity were consistent with the changes of gene expression.[Conclusion]This study showed that APX and GR were involved in the resistance response of wheat to stripe rust.

Key words Wheat stripe rust;Ascorbate peroxidas;Glutathione reductase;Enzyme activity;Gene expression

小麥条锈病是由条锈菌（Puccinia striiformis f.sp.Tritici）侵染引起的世界性气传病害[1]，具有危害性强和发生面积广等特点，对小麦的产量与品质造成严重影响。条锈病及其他逆境胁迫致使小麦植株过度积累H2O2等活性氧[2]，这些活性氧可直接攻击膜系统中的不饱和脂肪酸，破坏细胞膜的结构与功能[3]。细胞内有多种抗性酶，可有效清除活性氧，维持细胞的氧化还原平衡，保护植物免受伤害[4]。其中，抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）是抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环中的2个关键酶，APX可利用AsA将H2O2还原成H2O，GR可借助还原力NADPH催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原生成还原型谷胱甘肽（GSH），对GSH的再生、维持胞内高比率 GSH/GSSG 及植物细胞的氧化还原平衡有重要意义[5]。前人研究发现，条锈菌侵染可使叶片APX基因表达升高[6]、活性增强[7-8]、GR活性降低[9]，感病小麦中活性氧水平比抗病小麦高[9-11]，这些研究集中于小麦的叶片，着重于对“源-流-库”中“源”的变化，作为条锈菌直接侵染的营养器官，条锈菌活体寄生于叶片，叶片中抗性酶的变化很难排除寄生菌菌丝的影响。由于条锈菌没有直接侵染籽粒，尚未发现针对“库”器官籽粒中抗性酶变化的报道，籽粒的生理功能不同于叶片，其代谢与叶片的差异也较大[12]。由于籽粒未受到条锈菌的直接侵染，籽粒中抗性机制的研究更能说明小麦植株的整体变化。该研究以发育中的籽粒为材料，分析条锈菌与小麦互作中APX、GR基因表达及酶活性的变化，探讨籽粒对条锈病的抗性应答反应，以丰富小麦的抗病机理。

1 材料与方法

1.1 供试材料与田间处理

大田试验于2018—2019年在河南郑州师范学院试验田（113.62°E，34.91°N）进行。采用裂区设计，设置2个主处理，分别是对照区（CK）和条锈病发病区（T），2个区间隔20 m，间隔区域种植抗病品种赛德麦601作为隔离行，使其保护隔离。副处理为抗病性不同的2个冬小麦品种，分别为抗病品种赛德麦601和感病品种郑麦379。副区面积为2 m×3 m，副区间间隔1 m。对照区的副区之间种植0.5 m的抗病品种作为隔离行，发病区的副区之间种植感病品种作为诱发行，诱发小麦条锈病发病。于2019年4月28日开始，将感条锈病叶片撒入感病区进行接种，每隔5 d接种1次，使其发病。其他管理同一般高产田。

1.2 田间取样与条锈病调查

在花后15 d（15 DAA）、20 d（20 DAA）、25 d（25 DAA）和30 d（30 DAA）进行取样，选取典型的病情差别较大的植株麦穗，剥取穗中部的籽粒，于-80 ℃超低温冰箱保存。

使用小麦0～9级调查方法[13]，调查取样植株的旗叶、倒二叶、倒三叶的感病程度，以病斑占叶片面积百分比进行分级。公式为DI=Σ（各级病叶数×发病级别）/（调查总叶数×最高级别）×100。

1.3 酶活性测定

粗酶液提取参考朱祝军等[14]的方法，APX活性测定参照Nakano等[15]的方法。以1 h氧化1 μmol AsA的酶量为1个酶活单位[μmol/（g·h）]。GR活性测定参照文献[16]的方法，以1 h消耗1 μmol NADPH2的酶量为1个酶活单位[μmol/（g·h）]。

1.4 基因表达测定

参照杨阳[17]的方法提取小麦总RNA，用紫外分光光度计测定RNA浓度，吸光值OD260/OD280值为1.8～2.0，说明所提总RNA质量良好。参照反转录试剂盒（TAKARA）说明书进行反转录。根据APX和GR的GeneBank登录号，用 Primer Premier 5.0 / NCBI Primer-blast设计引物，在小麦基因组网站（http：//plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Transcript/Sequence_cDNA）寻找这2个基因的同源序列，通过Snapgene软件将设计好的引物与其进行比对，筛选出特异性引物序列（表1），选用小麦肌动蛋白基因（Actin）作为内参基因，引物由河南尚亚生物技术有限公司合成。

依据试剂盒（TAKARA）使用说明进行qRT-PCR，采用20 μL扩增体系，每个样品设3次重复。对扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，验证抗性酶基因引物扩增产物的分子量。

1.5 统计分析方法

采用SPSS 17.0对数据进行均值及标准误差分析。使用相对定量法进行基因的表达分析，用2-△△Ct法进行数据分析，试验结果采用Excel 2003和SPSS 17.0进行统计分析。

2 結果与分析

2.1 小麦植株条锈病调查结果

对取样的小麦植株进行病情调查，结果（表2）显示，无论是抗病品种还是感病品种，CK的病情指数均为0。15 DAA时期，抗病品种开始发病，病情指数为0.67，在25 DAA和30 DAA时期病情指数分别为4.23和4.57，整体上病情较轻;感病品种在15 DAA时期病情指数已达7.65，在20 DAA病情指数升高至26.98，随后一直持续升高至30 DAA，病情较为严重。

2.2 琼脂糖凝胶电泳结果

对扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，条带见图1，与设计片段长度一致。

2.3 小麦条锈病对APX基因表达量及酶活性的影响

从图2可见，接种条锈菌10 d后，即在15 DAA时期，抗病品种赛德麦601中APX基因表达量略有升高（为CK的1.41倍），在20 DAA有一个大幅度的上调表达，上调至CK的9.83倍，在15和20 DAA时期均达到显著差异水平（P<0.01），在25 DAA、30 DAA时期恢复至与CK较为接近的水平。整体上抗病品种除了20 DAA时期上调幅度较大之外，其他时期变化幅度很小，是CK的1.08～1.41倍。感病品种郑麦379的APX基因表达持续升高，15 DAA至25 DAA时期，表达量分别是CK的5.45、1.82和11.45倍，15 DAA至25 DAA时期均达到差异显著水平（P<0.05），在30 DAA时期，恢复至与CK几乎相同的水平。

从图3可见，接种条锈菌对小麦籽粒APX酶活性也产生了显著影响，抗病品种赛德麦601 APX酶活性呈持续升高趋势，升高幅度是CK的0.14～1.10倍，仅25 DAA时期几乎没有变化，酶活性变化趋势与基因表达一致。感病品种郑麦379的APX酶活性在15 DAA～30 DAA时期持续升高，达到显著差异水平（P<0.05），升高幅度在25 DAA时期高达5.34倍，高于抗病品种的升高幅度，APX酶活性的变化与基因表达量的变化一致。

在条锈病发病较为严重的时期（15 DAA～25 DAA），抗病品种赛德麦601在20 DAA时期APX基因表达和酶活性升高，推测APX表达和酶活的升高会使细胞内的ASA、GSH等消耗，以清除该时期骤然升高的活性氧。随后，在25 DAA时期抗病品种赛德麦601的APX表达和酶活性与CK持平，推测是籽粒细胞中活性氧恢复至正常水平，处于一种较为稳定的氧化还原状态，这可能是抗病品种对条锈菌胁迫的抗性应答反应。而感病品种郑麦379的APX表达和酶活性持续升高，推测是细胞中的活性氧水平较高，未得到及时、有效清除所致。

2.4 小麦条锈病对GR基因表达量及酶活性的影响

由图4、5可知，抗病品种赛德麦601的GR基因表达量在15 DAA和20 DAA时期与CK相差不大，在25 DAA和30 DAA时则显著升高（P<0.05），分别为CK的2.09、1.92倍;GR酶活性的变化与基因表达量的变化相同，在15 DAA、20 DAA与CK相差不大，而在25 DAA和30 DAA时期则显著升高，升高至CK的1.27、2.11倍。抗病品种赛德麦601中GR基因表达水平和酶活性在25 DAA、30 DAA时期的升高，推测与细胞中GSH水平的升高有关。

感病品种郑麦379的GR基因表达量在15 DAA和20DAA时期显著升高（P<0.05），分别是CK的1.43倍和1.65倍，在25 DAA和30 DAA显著降低（P<0.05），分别是CK的0.76倍和0.65倍，呈先升高后降低的趋势。GR酶活性也呈现先升高后降低的趋势，在20 DAA时期也显著升高（P<0.05），比CK升高1.15倍，在25 DAA和30 DAA時期显著降低，这种变化与基因表达量的变化一致。在15 DAA和20 DAA时期GR基因表达水平和活性升高推测细胞中GSH水平较高，GSH中的活泼巯基可增强小麦籽粒的抗氧化能力。

3 结论与讨论

该研究结果表明，不同感病性的小麦，籽粒APX和GR基因表达与活性对条锈病的应答也不同。条锈菌侵染抗病品种后，APX基因表达和酶活性在籽粒发育中期短时间骤增后恢复正常水平，GR基因表达和酶活性在籽粒发育后期升高。田间条锈病较严重的20 DAA时期，抗病品种赛德麦601虽然病情指数较低，但是细胞内APX表达和酶活性骤然升高，推测是应答该时期活性氧的骤然升高所致，引起ASA短时间被大量消耗而降低。前人有关叶片的研究也证实，条锈菌侵染可引发H2O2含量升高，ASA含量降低[9，11]，与该研究ASA含量降低的推测一致。抗病品种赛德麦601的GR基因表达和活性仅在25 DAA和30 DAA时期有所升高。有研究也发现，抗病小麦接种条锈菌1、2和5 d后，会引起叶片GR活性的升高[9]，胁迫条件下GR酶活性的增加，有利于提高植物的耐受性[18-19]。由于GR对GSH的再生，维持细胞的氧化还原平衡具有重要意义[5]，推测25 DAA、30 DAA时期细胞中GR表达和活性的升高可引起GSH水平升高，以维持细胞内高比率 GSH/GSSG 及氧化还原平衡，这与该时期APX表达和酶活性恢复至正常水平的结论一致，在抗病品种中，APX和GR起到接力的作用，APX在前，GR在后，依次应答条锈菌侵染。

条锈菌侵染感病品种后，APX基因表达和酶活性在籽粒发育4个时期持续升高，GR基因表达和酶活性在籽粒发育中期短时间升高后降低。15 DAA至30 DAA时期，感病品种郑麦379的APX表达和酶活性持续升高，推测籽粒细胞处于较高的活性氧水平，未得到有效清除。前人关于叶片的研究显示，条锈菌侵染使得感病小麦比抗病小麦积累了更高水平的活性氧[20]，APX基因表达升高[6]，APX活性增强[7-8]，这与该研究籽粒中的变化一致。白粉菌、稻瘟病菌（Pyriculariaoryzae）等其他真菌侵染小麦后也发现叶片中APX活性升高[21-22]，另有白粉菌侵染大麦引发叶片中APX活性持续升高的报道[23]。有研究发现有关小麦白粉病引发籽粒APX在蛋白水平的表达升高[24]。这些研究与该研究结论一致。该研究结果表明，感病品种郑麦379的GR基因表达和酶活性在20 DAA短时间升高后，在25 DAA、30 DAA时期降低，推测这个短暂的升高有助于细胞中H2O2等活性氧水平的降低，但不足以降低至正常的活性氧水平，这种持续的、高水平的活性氧最终引发小麦受到氧化损伤，导致后期GR基因表达和活性的降低。前人也有关于条锈病引发感病小麦叶片GR活性降低的报道[9]，与该研究25 DAA、30 DAA时期的降低一致。

综上所述，感病品种清除活性氧的能力有限，条锈病可诱发感病品种APX基因表达和活性持续升高以应对锈病引发的H2O2持续积累，而GR基因表达和活性短暂升高后降低。而抗病品种可有效清除细胞中短时间升高的活性氧，条锈病可诱发抗病品种APX基因表达和活性升高，GR基因表达和活性的升高略为滞后，以维持细胞中的氧化还原状态的平衡，这可能是抗病品种抗性的一种体现。

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