基于转录组的金花茶PEBP基因家族的鉴定及分析

刘合霞 刁慧玲 舒杨 谭肖玲 韦晓晓 李妍 龙开芸 苏雅萍 赵娇妹 李博

摘要 磷脂酰乙醇胺結合蛋白 （phosphatidyl ethanolamine binding protein， PEBP）在花的形态建成中具有重要作用，为了解该基因家族在金花茶开花过程中的调控作用，通过对金花茶的花瓣转录组测序数据进行生物信息学分析，从转录组数据库中筛选金花茶（Camellia nitidissima）PEBP基因，并对其蛋白质性质、功能结构域、进化关系及开花过程中的表达模式进行了分析。结果表明，金花茶花瓣转录组中共含有9个PEBP基因家族成员，可以分为FT-like、TFL1-like、MFT-like、PEBP-like 4个亚基因家族;该蛋白家族主要由酸性、亲水的稳定蛋白构成，定位于细胞核中;该基因家族Motif具有一定的保守型，且所包含的保守基序数目及种类存在一定差异。在金花茶开花过程中，CnPEBP 4基因的表达量不断增高，该基因可能对金花茶花瓣形态建成具有一定的调控作用;而其他基因家族成员在金花茶花瓣组织中表达量较低或不表达。鉴定获得了金花茶PEBP基因家族成员的序列和部分功能信息，为研究金花茶开花调控提供了理论参考，为金花茶开花调控机理的研究奠定基础。

关键词 PEBP基因家族;金花茶;保守基序;进化分析;表达量分析

中图分类号 S-685.14  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）13-0103-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.025

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Transcriptome wide Identification and Expression Profiling of PEBP Gene Family in Camellia nitidissima

LIU He xia， DIAO Hui ling， SHU Yang et al

（College of Biology and Pharmacy， Yulin Normal University， Yulin， Guangxi 537000）

Abstract Phosphatidyl ethanolamine binding protein （PEBP） plays an important role in the formation of flower.In order to konw the function of PEBP gene family of Camellia nitidissima in blossom， PEBP gene family was selected from the transcriptome database of petal in Camellia nitidissima with bioinformatics analysis， and their protein properties， functional domains， evolutionary relationships and expression patterns during flowering were analyzed.The results showed that there were a total of 9 PEBP gene families in the petals transcription of Camellia nitidissima， which could be divided into four sub gene families， such as FT like， TFL1 like， MFT like， PEBP like， etc.The protein family is mainly composed of acidic， hydrophilic and stable proteins located in the nucleus.In addition， the Motif of this gene family had a certain conservative type， and there were some differences in the number and types of conservative motifs.During the flowering process of Camellia nitidissima， the expression level of CnPEBP4 gene increases continuously， which may had a certain regulatory effect on the petal morphological formation of Camellia nitidissima， but other gene family members showed low or no expression.In this study， the sequence and partial functional information of the PEBP gene family members of Camellia nitidissima were identified， which provided theoretical reference for the study of flowering regulation and laid a foundation for the study of flowering regulation mechanism of Camellia nitidissima.

Key words PEBP gene family;Camellia nitidissima;Conserved motif;Phylogenetic analysis;Expression analysis

在植物分类系统中，金花茶（Camellia nitidissima）属于山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）植物，于1965年在我国广西首次被发现，主要分布于我国广西南部地区及越南北部地区，是山茶属中唯一具有金黄色花瓣的珍稀植物类群，素有“茶族皇后”“植物界的大熊猫”的美誉[1]。金花茶花瓣金黄色，具有较高的观赏价值，同时也是一种药食两用植物，含有茶多酚、茶多糖、黄酮类等生理活性成分，此外还含有对人体健康有益的多种微量元素，如锗、锰、有机硒等元素[2]。金花茶具有清热解毒、利尿消肿等功能，可用于治疗咽喉肿痛、小便出血、月经失调、高血压、痢疾等疾病，另外，现代药理学的研究也表明金花茶具有杀菌、抗癌、防治“三高”等作用[3-5]。金花茶的观赏价值、经济价值及药用价值均较高，因此对其进行保护、开发和利用具有重要意义[6-7]。其中，金花茶的花朵是主要开发利用资源，被制成各种茶类和保健品，市场销售良好，因此研究金花茶开花过程中的调控机制，了解金花茶开花过程的分子调节机理，对于金花茶资源进一步的开发利用具有重要的理论价值。

在高等植物中，磷脂酰乙醇胺结合蛋白（Phosphatidy ethanolamine-binding protein， PEBP）基因家族广泛存在，该基因家族具有调控植物开花及株型分化的功能[8]。PEBP基因可划分为FT（FLOWERING LOCUS T）、TFL1（TERMINAL FLOWER 1）和MFT（MOTHER OF FT AND TFL1）[9]等亚基因家族，不同亚基因家族的功能存在着差别，如MFT亚基因家族可调控繁殖器官发育，其主要在种子中发挥作用;而FT和TFL1亚基因家族在调控开花中发挥作用，FT促进开花，TFL1则抑制开花[10]。目前，有关于PEBP基因在拟南芥中的组成及功能研究较多[11]，但随着对PEBP研究的不断深入，许多不同类别植物的PEBP基因家族都已被鉴定，如白云杉（Picea glauca）、挪威云杉（Piceaabies）、花旗松（Pseudotsugamenziesii）等裸子植物[12]，猕猴桃（Actinidia chinensis）[13]、大豆（Glycine max）[14]、杨树（Populustremula）[15]、葡萄（Vitis vinifera）[16]等双子叶植物，玉米（Zea mays）[9]、水稻（Oryza sativa）[17-18]等单子叶植物。通过对被鉴定出的PEBP家族成员的结构及功能进行分析，发现这些物种中PEBP基因家族成员的同源性较高，且调控开花的作用机制相似。

目前，有关于山茶科植物中PEBP基因的研究报道较少，只有茶树的PEBP基因被鉴定及克隆[19]。随着金花茶花芽及花瓣等组织转录组测序的完成，为金花茶PEBP家族基因的研究提供了有力的资源[20-21]。该研究通过生物信息学方法对金花茶PEBP基因家族进行鉴定，分析PEBP基因家族成员的理化性质、蛋白质保守基序、系统进化关系及开花过程中的表达模式，旨在为进一步了解金花茶PEBP基因家族成员的组成及其开花调控机理的进一步研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料 获取已知拟南芥PEBP基因家族成员的蛋白质序列，这些序列主要通过NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载，然后将其作为Query序列，以对不同发育时期金花茶花瓣转录组测序所获得的编码序列为目标序列，搜索金花茶转录组中PEBP基因家族。

1.2 方法

1.2.1 金花茶PEBP基因家族成员鉴定。

搜索金花茶转录组测序数据中PEBP基因家族的过程，通过本地Blast比对来完成，阈值参数设为 E<10-5;然后检测候选的蛋白序列是否存在PEBP蛋白保守结构域，排除不符合要求的基因，该检测过程利用在线软件NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）[22]来完成。

1.2.2 金花茶PEBP蛋白质的理化性质及保守结构元件分析。

对金花茶PEBP基因家族成员蛋白质的性质，如等电点、脂肪系数、不稳定系数、平均亲水系数、分子量等进行分析，主要通过在线网站ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/） [23] 完成。同时对蛋白质进行亚细胞定位预测;利用在线工具MEME（http：//meme suite.org/）[24]来预测金花茶PEBP基因家族成员的保守结构元件，其中Motifs 数量设为10个，保守位点宽度为6～50;PEBP基因家族成员的基因结构和Motif序列，通过TBtools软件来展示。

1.2.3 金花茶PEBP基因家族系统进化树的构建。

采用Neighbor joining法，利用MEGA10软件[25]，对搜寻获得的金花茶PEBP蛋白序列，下载获得的水稻和拟南芥PEBP蛋白质序列构建系统进化树，将Boot strap参数值设定为1 000，其他参数设为默认值。

1.2.4 金花茶PEBP基因家族表达模式分析。

利用开花过程中金花茶花瓣转录组测序获得的PEBP基因家族的表达量数据来绘制表达量热图[20]，该过程主要使用R语言软件来完成。开花过程分为幼蕾期（S1）、初蕾期（S2）、显色期（S3）、半开期（S4）、盛开期（S5）5个时期（图1）[20]。

2 结果与分析

2.1 金花茶PEBP基因家族的鉴定与分析

以拟南芥PEBP蛋白质序列为Query序列进行本地Blast比对，搜索金花茶花瓣转录组中的PEBP基因家族成员，共获得13条PEBP序列，经CCD 在线数据库分析后，最终鉴定获得9个PEBP基因家族成员。按照转录组中unigene的ID号，根据从小到大的顺序对金花茶PEBP基因家族成员进行编号，即CnPEBP 1～CnPEBP 9（表1）。对金花茶PEBP基因编码蛋白的理化性质进行预测分析，结果显示，金花茶9个PEBP基因的编码氨基酸数目及编码蛋白质理论分子量分别为109～282个、12.33～28.04 kD;该蛋白家族的理论等电点为4.81～8.87，其中CnPEBP 2、CnPEBP 3、CnPEBP 4、CnPEBP 5及CnPEBP 7的理论等电点值大于7，为碱性蛋白;且该蛋白家族的不稳定指数和脂肪系数分别为32.88～49.82、69.72～90.88，其中有5个蛋白的不稳定指数小于40，为稳定蛋白;除了CnPEBP 6以外，平均親水系数均小于0，说明各蛋白均为亲水性蛋白。对金花茶PEBP蛋白家族的亚细胞定位预测分析，发现主要包括3种类型，即CnPEBP 2定位于细胞质，CnPEBP 1、CnPEBP 4、CnPEBP 5、CnPEBP 6和CnPEBP 7定位在细胞核，CnPEBP 3、CnPEBP 8、CnPEBP 9定位于细胞核及细胞质中。以上对金花茶PEBP蛋白基本理化特性的分析结果表明， PEBP基因编码的蛋白在氨基酸序列长度和蛋白特性变化上存在一定差异，该蛋白家族主要由酸性、亲水的稳定蛋白构成，且主要定位于细胞核中。

2.2 金花茶PEBP保守基序分析

利用MEME在线工具对筛选得到的9个金花茶PEBP基因家族成员的保守基序进行分析，发现共有10个保守基序存在于PEBP基因家族中，将其命名为 Motif 1～Motif 10，鉴定的基序长度为6～50个氨基酸，每个PEBP中保守基序的数目为3～6个（图2、3），其中Motif 7出现次数最少，只有2次，Motif 4、Motif 8出现3次，Motif 2、Motif 5、Motif 6、Motif 9均出现4 次，Motif 1出现7次，Motif 3出现的次数最多，为9次。综合PEBP基因家族进化分析，发现PEBP蛋白的亚组成员共享1个或多个相同的基序，属于同一亚组的PEBP基因成员表现出相似的Motif组成，说明它们在功能上可能具有相似性;此外，有些基序只出现在特定的子群中。金花茶PEBP基因家族的保守基序分析结果表明，该基因家族Motif具有一定的保守型，且所包含的保守基序数目及种类存在一定差异。

2.3 金花茶PEBP蛋白系统进化分析

利用金花茶9个PEBP蛋白序列，拟南芥6个PEBP蛋白、水稻18个PEBP蛋白一起构建系统进化树，进而探究金花茶PEBP基因家族的系统发育关系。研究结果发现（图4），金花茶PEBP基因家族被分为ClassⅠ（FT-like）、ClassⅡ（TFL1-like）、ClassⅢ（MFT-like）、ClassⅣ（PEBP-like）4个亚族，每个亚族所含有的基因数分别是4、2、1、2个。FT-like亚族包括CnPEBP 6、CnPEBP 7、CnPEBP 8、CnPEBP 9蛋白、拟南芥AtFT和AtTSF蛋白、水稻中发现的FT同源蛋白;第2个独特的单系分支（TFL1-like）由金花茶CnPEBP 2和CnPEBP 5 2个蛋白、拟南芥AtTFL1、AtATC、AtBFT蛋白以及水稻中发现的假定同源蛋白组成;MFT-like亚族则包括CnPEBP 3蛋白，拟南芥AtMFT，水稻中发现的MFT同源蛋白;第4个亚枝由含有保守PEBP蛋白结构域的CnPEBP 1、CnPEBP 4、水稻OsUPF蛋白质组成，该结构域是细菌和古细菌所特有的结构域。另外，系统进化分析还发现，金花茶与拟南芥的亲缘关系较近，与水稻亲缘关系较远，该结果符合植物分类标准。

2.4 金花茶PEBP基因家族表达分析

为了解金花茶PEBP基因家族在金花茶花瓣发育过程中的表达情况，对PEBP基因家族在开花过程中花瓣组织的表达量进行了研究，结果表明，该家族成员存在特异表达模式，主要可以划分为3种类型（图5）。在金花茶开花过程中，CnPEBP 4表达量不断增高，该基因可能对金花茶花瓣形态建成具有一定的调控作用;CnPEBP 3与CnPEBP 7的表达模式相近，它们在金花茶开花的某个阶段表达量有所提高;而CnPEBP 1、CnPEBP 2、CnPEBP 5、CnPEBP 6、CnPEBP 8、CnPEBP 9在各种花瓣组织中表达量较低或不表达，它们的表达模式类似，结果表明，金花茶PEBP基因家族在花瓣发育过程中的表达量存在差异。

3 讨论

PEBP基因家族在植物的成花转变、花形态建成以及种子發育和萌发中发挥重要作用，该基因家族成员数量在单子叶和双子叶植物中存在较大差异，在单子叶植物中PEBP基因数量相对较多[11]。该研究通过本地数据库Blast比对，搜寻得到9个金花茶PEBP基因家族成员，其成员数目多于葡萄、黄瓜（Cucumis sativus）、毛果杨（Populus trichocarpa）等双子叶植物，但远少于小果野蕉（Musa acuminata）、玉米、高粱（Sorghum bicolor）等单子叶植物[12]。对金花茶PEBP蛋白的理化性质进行预测，发现除了CnPEBP 6，其余金花茶PEBP蛋白均为亲水性蛋白，该特性符合植物PEBP蛋白的亲水特征[26];植物蛋白质不同的亚细胞定位与其生物学功能密切相关，亚细胞定位结果发现金花茶PEBP蛋白主要分布于细胞质及细胞核中，与番茄（Solanum lycopersicum）[27]、拟南芥[28]的PEBP蛋白亚细胞定位结果类似，与小麦[26]、龙眼（Dimocarpus longan）[29]的PEBP蛋白亚细胞定位结果不同。

PEBP基因家族的系统进化分析表明，大部分植物PEBP基因被划分为FT-like、TFL1-like、MFT-like 3个亚族[9]。在该研究中，金花茶的9个CnPEBP基因则被分成FT-like、TFL1-like、MFT-like、PEBP-like 4个亚家族，其中FT-like亚家族中成员最多，含有4个CnPEBP基因，TFL1-like和PEBP-like亚家族成员次之，各含有2个CnPEBP基因，MFT-like亚家族成员最少，只有1个CnPEBP基因。构建的金花茶PEBP基因家族系统进化树与陆地棉（Gossypium hirsutum）PEBP基因家族类似[30]，与许多植物PEBP基因家族的划分类型相比，它们都多含了1个PEBP-like亚家族，并且2个物种的PEBP-like亚家族均含保守的PEBP结构域，该结构域具有细菌和古细菌特有结构域（PEBP_bacteria and archaea），与大部分植物所含的真核生物特有结构域（PEBP_eukaryote）不同。综合金花茶PEBP蛋白的理化性质及具有的保守结构域类型进行分析，结果显示，金花茶TFL1-like亚家族及MFL-like亚家族均为不稳定蛋白;除了CnPEBP 7，FT-like亚家族及PEBP-like亚族蛋白均为稳定蛋白;稳定蛋白及不稳定蛋白所含的保守结构域类型完全不同，因此认为金花茶PEBP蛋白所含保守结构域类型对金花茶PEBP蛋白稳定性及亚家族分类有一定的影响。

目前，在多种植物中鉴定了众多PEBP基因并对其功能进行了研究，发现亚基因家族的功能各不相同。比如FT-like亚基因家族可促进开花，TFL1-like亚基因家族抑制开花，MFT-like亚基因家族促进种子萌发[10]。该研究对金花茶PEBP基因家族在开花过程中花瓣组织的表达情况进行了研究，结果发现该家族成员存在特异性表达模式，主要可以划分为3种类型。PEBP-like亚家族基因CnPEBP 4在金花茶开花过程中表达量不断增高，根据其表达量推断该基因可能对金花茶花瓣形态建成具有一定的调控作用;MFT-like亚家族基因CnPEBP 3与FT-like亚家族基因CnPEBP 7的表达模式相近，它们在金花茶开花的某个阶段表达量有所提高;而其余的PEBP基因表达量较低或不表达，例如金花茶TFL1-like亚家族的基因CnPEBP 2和CnPEBP 5。TFL1基因具有抑制开花的功能，其mRNA水平随着营养生长向生殖生长的过渡会下降，例如，苹果（Malus × domestica.）[31]、日本杏（Prunus armeniacal）[32]、枇杷（Eriobotrya japonica）[32]等蔷薇科植物TFL1基因的表达量会随着花芽分化而显著降低，在该研究中金花茶TFL1-like亚家族也具有类似的情况，基因的低表达量对开花过程难以发挥抑制作用，从而保证金花茶能够正常开放。MFT或FT同源基因在龙眼[33]、麻风树（Jatropha curcas）[34]等植物繁殖器官中中度表达的情况较为常见，类似的同源基因可能具有维持繁殖器官发育的作用[34-35]，因此推断在金花茶开花某个阶段中度表达的MFT like亚家族基因CnPEBP 3、FT-like亚家族基因CnPEBP 7可能也具有维持繁殖器官发育的功能，但具体的生物学功能仍需研究。该研究获取了金花茶PEBP基因家族成员的序列和部分功能信息，为进一步了解金花茶PEBP基因家族成员的组成及其开花调控机理打下基础。

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