橡胶树灵芝茎腐病病原菌鉴定及其生物学特性测定

胡真臻 李增平 单金雪 张宇 熊秋雨 吴如慧

摘  要：在海南省澄迈等地的橡胶树林地发现一种新的茎腐病，由灵芝属的一种木腐菌侵染橡胶树活立木的茎干引起，株发病率约为1%～2%，田间发生茎腐病的断干橡胶树植株，新抽枝条上的叶片失绿，无光泽，变黄后脱落，后期树冠稀疏，生长不良、枯枝，病树茎干木质部组织白腐，重病植株整株枯死。对该病害的病原菌进行致病性测定、形态学特征鉴定，并建立ITS、LSU和SSU多基因系统发育树。结合形态学鉴定和多基因系统发育树鉴定结果，海南橡胶树灵芝茎腐病的病原菌鉴定为南方灵芝[Ganoderma austral （Fr.） Pat.]。生物学特性测定结果表明，该菌的菌丝最适生长条件为：温度30 ℃，pH 6.0，黑暗条件，马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基培养。

关键词：橡胶树;茎腐病;南方灵芝;生物学特性

Abstract： A new stalk rot disease was found in rubber forests in Chengmai， Hainan Province. It was caused by a wood rot fungus of Ganoderma infecting the stems of live rubber trees. The incidence rate of the plant was about 1%-2%， which occured in the field. When rubber trees were infected by this stem rot disease， the leaves on the newly extracted shoots were chlorotic， dull， and fell off after yellowing. Later the crowns were sparse， poor growth， branches dead， and tissues of diseased stem xylem white rot. Some plants die when they were seriously ill. The pathogenicity and morphological characteristics were determinated， and the ITS， LSU and SSU multigene phylogenetic trees were established. Results showed that the pathogen causing stem rot of Hevea brasiliensis was Ganoderma austral （Fr.） Pat. Tests on biological characteristics showed that the optimum identified growth conditions for G. austral were 30 ℃， pH 6.0， continuous darkness， PDA.

Keywords： Hevea brasiliensis; stem rot; Ganoderma austral （Fr.） Pat.; biological characteristics

橡膠树（Hevea brasiliensis）为大戟科橡胶树属的产胶热带作物，原产于巴西的亚马逊森林，所产的天然橡胶是重要的国防战略物资。中国的橡胶种植区主要分布在海南、福建、云南、广东、广西等省（区）[1-2]。2004年的统计数据表明，橡胶树上发生的病害有117种，危害较重的病害有南美叶疫病、季风性落叶病、白粉病、炭疽病、棒孢霉落叶病、红根病和褐根病等[2]。近年来又在印度尼西亚、马来西亚和泰国等地发生一种危害严重的拟盘多毛孢叶斑病[3]，此外还发现有回枯病[4]、毛色二孢叶斑病等新病害[5]。

海南是我国天然橡胶的主产省份之一，属于典型的热带季风气候，每年7—9月的台风常发季节期间，台风会吹断许多橡胶树，形成大量伤口，而枝条、茎干上的断口为一些种类的病原灵芝菌的侵染和定殖创造了良好条件[6]。笔者在对海南省澄迈等地的橡胶树林地进行病害调查时，发现灵芝属的一种木腐菌侵染橡胶树活立木的茎干引起茎腐病，株发病率约为1%～2%，重病植株整株枯死，取名为橡胶树灵芝茎腐病，而有关灵芝属真菌引起的橡胶树茎腐病尚未见相关的文献报道。

本研究对此灵芝菌引起的橡胶树茎腐病进行研究，分离出病原菌进行致病性测定，利用形态学、分子生物学方法对其种类进行鉴定，完成柯赫法则，然后对该种病原灵芝菌进行了生物学特性的初步研究，以期后续为进一步研究该病害的发生流行规律及有效的防控策略提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  担子果来源地  担子果于2017年9月从海南省澄迈县、儋州市、保亭县、定安县等地的发病橡胶树采集。

1.1.2  培养基  马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、Ricard培养基、燕麦培养基、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基、橡胶树茎干煎汁培养基、玉米培养基[7]、木屑培养基[8]。

1.1.3  试剂、实验器材及仪器  OMEGA FungalDNA Kit，2Taq-Mixture，OMEGA Extraction Kit，DNA Marker、通用引物（见表1）。打孔器（5 mm），Olympus BX 51显微镜。

1.1.4  技术支持  引物合成、PCR产物测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2  方法

1.2.1  菌株的获得  先用无菌棉蘸取70%的酒精擦拭新鲜的担子果表面，使用手术刀削除分离部位的外层菌肉，后切取少量内层的菌肉接到PDA培养基上，在28 ℃恒温下培养，挑取可能的菌株进行进一步分离纯化，根据菌落形态筛选符合的菌株，筛选获得XJSJF003菌株，将该菌株扩繁和保存，作为研究菌株进行后续相关研究[7]。

1.2.2  接种体的制备  将纯化后的XJSJF003菌株菌落接种在已灭菌的袋装木屑培养基中，在室温下黑暗培养20 d左右，菌丝长满木屑培养基的表面便可进行接种。空白对照为接入空白PDA培养基块的木屑培养基。

1.2.3  致病性测定和担子果诱导  参考吴如慧等[9]的方法，将1.2.2制备好的已接种XJSJF003菌株的木屑培养基接种在海南大学植物保护学院教学基地培育的2年生‘7-33-97橡胶树芽接幼树上。设置5个重复，对照株用1.2.2制备的空白木屑培养基。接种后每隔7 d对苗木长势和侵染情况进行观察，并拍照记录。另挑取XJSJF003菌株纯化后的菌丝块放置于已灭菌的瓶装木屑培养基中，28 ℃下培养，待菌丝长满瓶内培养基表面后，开盖放置于保湿器中诱导担子果，然后定时观察担子果的生长情况，并拍照记录。

1.2.4  病原菌的鉴定  形态鉴定。描述采集的担子果样本的宏观特征，通过显微镜观察并测量病原菌的顯微结构并拍照，描述担子果的显微结构，通过宏观特征和微观结构结合资料对比鉴定[10]。

分子鉴定。提取XJSJF003菌株的DNA，参考邢佳慧等[11]、袁滨等[12]、Abbot等[13]文献，用3对通用引物扩增ITS、LSU和SSU基因的片段（表1）。获得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测有条带，后进行切胶回收目的片段，纯化后进行测序。获得的PCR产物测序结果上传到NCBI上，进行BLAST比对分析，并从GenBank中下载部分灵芝属及其他属中同时含有ITS、LSU、SSU基因的菌株，将它们的3种基因用SequenceMatrix软件串联，用MEGA 7.0软件对串联片段序列进行系统发育分析，使用邻接法（neighbor joining method）建立系统进化树分析鉴定XJSJF003菌株。

1.2.5  生物学特性测定  从温度、光照、pH、不同培养基4个维度进行生物学特性的测定，培养6 d的XJSJF003菌株用打孔器从菌落的边缘打取菌饼，然后将菌饼接种在不同供试培养基上进行培养，6 d后测量菌落直径。每种培养条件设置3个重复。温度、光照、pH实验均使用PDA培养基。

（1）不同培养基：PDA培养基、Ricard培养基、燕麦培养基、PSA培养基、橡胶茎干煎汁培养基、玉米培养基，28 ℃培养。

（2）温度：设置15、20、25、28、30、35、37 ℃，并在黑暗条件下培养。

（3）光照：设置完全黑暗、持续光照、12 h光暗交替，28 ℃培养。

（4）pH：用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节pH，pH分别设置2、3、4、5、6、7、8、9，28 ℃培养。

1.3  数据处理

利用Excel 2019软件统计记录数据进行基础分析，利用SAS 9.1软件Duncans multiple range test进行数据差异显著性分析。

2  结果与分析

2.1  病害症状

田间发生茎腐病的断干橡胶树植株，新抽枝条上的叶片失绿，无光泽，变黄后脱落，后期树冠稀疏，生长不良、枯枝（图1A，图1B），病树茎干木质部组织白腐（图1G），茎干自上而下回枯，重病植株整株枯死（图1C）。在病树的上部茎干、近地面的茎基部上长出檐状担子果（图1D，图1E，图1F）;有时可见地上部的茎干已枯死，但地下根系尚未死亡（图1H）;也有的风倒病株，发病茎干上已长出担子果，但倒杆上长出的枝叶仍保持绿色，半年后才整株枯死。

2.2  致病性测定

接种1个月后，拆开固定在接种苗木茎干伤口处的木屑培养基，接种XJSJF003菌株的橡胶幼树茎干接种处长满白色菌丝，内部组织已发生白腐，坏死逐渐向内部扩展，后茎干组织呈白色腐败状（图2A，图2B）。3个月后接种的橡胶幼树树冠稀疏，生长不良、叶片无光泽，6个月后病株整株枯死，10个月后病株基部长出檐状担子果，与田间发病症状一致（图2D），对照组则无明显变化（图2C）。取病组织再次进行常规组织分离，分离后可得到相同的菌株，表明分离菌XJSJF003菌株为该病的致病菌。将XJSJF003菌株接种在瓶装的木屑培养基上，1个月后白色菌丝布满整个培养基，4个多月后长出与病株上一样的担子果（图2E）。

2.3  病原菌的鉴定

2.3.1  形态观察  在PDA培养基上，菌株XJSJF003的菌落菌丝呈白色，近圆形，菌丝中间浓密，边缘显稀薄，平伏生长。老化后转变为乳白色或有浅黄色纹理。担子果多年生，无柄，刚生长时白色，长大后呈半圆形，上表面湿度大时呈黑褐色，干燥条件下呈浅褐色，被覆盖一层担孢子后呈灰褐色，近外围具明显的环带和环沟，有的环带凸起较明显，边缘显白色，下表面呈灰白色;老熟干燥后的担子果呈浅褐色，边缘显褐色，下表面棕褐色，密布小孔;菌管暗褐色。担子果大小为10～32 cm×9～18 cm，基部厚4～7.5 cm，边缘厚0.5～0.7 cm。担孢子南瓜子形，浅褐色，一端斜截，外壁光滑，大小为6.38～8.05 μm×4.02～ 4.93 μm，平均7.42 μm×4.46 μm（图3）。依据其形态特征，将此灵芝菌鉴定为南方灵芝[Ganoderma austral （Fr.） Pat.][10]。

2.3.2  rDNA-ITS序列比对和发育树构建  系统树聚类显示（图4），菌株XJSJF003与登录号为LC084717.1、LC084663.1、JX195204.1等菌株序列的相似度为99%。测序得到XJSJF003菌株rDNA-ITS和LSU、SSU序列分别为657 bp（登录号：MN747808）、1118 bp（登录号：MN744680）和572 bp（登录号：MN747807），从GenBank中下载相关灵芝菌的rDNA-ITS、LSU、SSU序列，使用3种序列进行联合建树（表2），结果显示，XJSJF003菌株的rDNA-ITS、LSU和SSU序列与南方灵芝[Ganoderma austral （Fr.） Pat.]的同源性达98%，表明该病原菌XJSJF003与南方灵芝[G. austral （Fr.） Pat.]的遗传距离最小，聚为一类。将已有的形态学鉴定和分子生物学鉴定结果相结合，最终确定引起橡胶树茎腐病的病原灵芝菌为南方灵芝[G. austral （Fr.） Pat.]。

2.4  生物学特性

2.4.1  不同培养基对南方灵芝  XJSJF003菌株在供试的6种不同培养基上均能生长，在PDA培养基上生长最快且菌丝层厚，其中橡胶茎干煎汁培养基、PSA培养基和燕麦培养基生长速度也较快、菌丝层较PDA培养基略薄，Ricard培养基生长较慢且菌丝层稀薄接近透明，玉米培养基上菌落生长最为缓慢，菌丝层较薄（表3）。

2.4.2  温度对南方灵芝菌丝生长的影响  在不同温度下XJSJF003菌落生长情况差异显著。在温度处于15～37 ℃之间，XJSJF003的菌丝都能生长，菌丝适宜生长的温度范围为25～30 ℃，最适生长温度为30 ℃，40 ℃时停止生长（图5）。

2.4.3  光照对南方灵芝菌丝生长的影响  不同的光照条件下XJSJF003菌落的生长有显著性差异。在全暗条件下菌落生长速度最快且菌丝的厚度最厚，在12 h的光暗交替培养下菌落的生长速度较慢一些，以全光照条件下的菌落长势最弱（图6）。

2.4.4  pH对南方灵芝菌丝生长的影响  不同pH条件对XJSJF003菌落生长的影响存在差异显著。XJSJF003在pH 2～9之间均可生长，pH为6和pH为7时，菌落直径无明显差异，最适生长pH为6～7，pH为4～7较pH为8时菌落生长速度快，差异显著（图7），表明南方灵芝较适宜弱碱性环境，更适合在弱酸性至中性环境中生长。

3  讨论

南方灵芝（G. austral）是灵芝属中的一种常见的病原木腐菌，在海南多个市县生长的非洲楝、桉树、木麻黄等树上也有发现，通过初步研究表明南方灵芝是这几种植物的致病菌。笔者在海南澄迈县胶林里发现引起橡胶树茎腐病的灵芝属木腐菌，并观察其形态学特征和进行分子生物学鉴定分析，结果表明，引起橡胶树灵芝茎腐病的病菌为南方灵芝（G. austral）。该病原菌最适pH为6.0;最适生长温度为30 ℃;在黑暗条件下生长迅速，光照对其生长可能存在抑制作用;在测定的几种不同培养基中，PDA培养基培养条件下病原菌长势最好。在田间调查中表明，病害产生的南方灵芝担子果形态可能和发病区的环境湿度、光照强弱有关，喷施药剂会导致担子果的形态发生变化。

灵芝属（Ganoderma）真菌均为木腐真菌，有些种是被人们常用作药用真菌[10]，有些种类如灵芝（G. lucidum）、长管灵芝（G. annulare）、橡胶灵芝（G. pseudoferreum）、热带灵芝（G. tropicum）、树舌灵芝（G. applanatum）、褐灵芝（G. brownii）、薄盖灵芝（G. capense）等会引起树木枯死或根腐病，是多种林木活立木上的重要病原菌[14]。但其中的许多种尚未完成柯赫法则及生物学特性测定等相关研究，有待对其进行更加深入的研究，以丰富相关病理学的研究内容。

田间调查发现，除在海南澄迈县发现有橡胶树灵芝茎腐病发生外，在儋州市、保亭县、定安县、昌江县等地，及云南省的勐腊均发现有橡胶树灵芝茎腐病的发生，其病原菌从形态特征判断也是南方灵芝。病原南方灵芝菌可从橡胶树的风断茎干伤口、风倒树干向上的日灼伤口等侵入定殖，引起橡胶树茎干组织白腐，并向茎干基部蔓延，直达根系，导致橡胶树整株枯死。在生产中，建议对风断树的断口及时进行修平，并涂防水涂剂以利其伤口愈合，风倒树要及时扶正处理，或对其易曝晒的茎干进行涂白或包裹防护，防止日灼损伤，预防病原南方灵芝菌的定殖为害。

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责任编辑：谢龙莲