异源双根对连作障碍下咖啡幼苗氧化损伤的缓解效应

孙燕 董云萍 龙宇宙 林兴军 赵青云 谭军

摘  要：以中粒種咖啡‘热研1号（Caffea canephora ‘Reyan No. 1）和大粒种咖啡1号（Caffea liberica No. 1）形成中粒种-大粒种异源双根咖啡和中粒种-中粒种同源双根咖啡，利用连作障碍咖啡园土壤开展幼苗培养试验，包括根际土培养异源双根咖啡（T1）和同源双根咖啡（T2），非根际土培养异源双根咖啡（T3）和同源双根咖啡（T4）。通过比较各处理植株过氧化氢（H2O2）及丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性及非酶抗氧化物含量，探讨异源双根对连作障碍下咖啡幼苗氧化损伤的缓解效应。结果表明：根际土培养后，T1较T2处理植株超氧化物歧化酶（SOD）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）等抗氧化酶活性显著提高，脱氢抗坏血酸（DHA）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）等非酶抗氧化物含量显著下降，H2O2及MDA含量显著下降，连作障碍下异源双根咖啡较同源双根咖啡受氧化损伤影响小。T1、T3处理间或T2、T4处理间，植株叶片H2O2及MDA含量差异均不显著;且叶片氧化损伤评价指标与植株抗氧化系统指标的相关性较差，叶片对连作逆境较不敏感。根系H2O2含量在T1、T3处理间或T2、T4处理间差异显著，而MDA含量在T1、T3处理间差异不显著，在T2、T4处理间差异显著，连作逆境使植株根系产生较多活性氧;根系氧化损伤评价指标与根系DHA、还原型谷胱甘肽（GSH）、GSSG含量极显著正相关，与SOD、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性极显著负相关，并且，与叶片DHA、GSH、GSSG含量及POD活性显著或极显著正相关，与SOD、GR、MDHAR、抗坏血酸氧化酶（AAO）、DHAR活性显著或极显著负相关，根系氧化损伤受根系及叶片抗氧化系统的共同影响。综上，连作障碍下，同源双根咖啡根系受氧化损伤大，异源双根咖啡通过根系及叶片抗氧化系统缓解根系氧化损伤。

关键词：咖啡;连作障碍;异源双根;抗氧化酶;非酶抗氧化物

Abstract： The soil of the continuous cropping obstacle garden of coffee was used to cultivate Caffea canephora ‘Reyan No. 1 / C. liberica No. 1 heterologous double-root grafting coffee seedlings and C. canephora ‘Reyan No. 1 homologous double-root grafting coffee seedlings. In order to study the mitigative effect of heterologous double-root on the oxidative damage of coffee seedlings under continuous cropping obstacle， the contents of H2O2， MDA and non-enzyme antioxidant and antioxidant enzyme activity among heterologous double-root coffee in rhizosphere soil （T1）， homologous double-root coffee in rhizosphere soil （T2）， heterologous double-root coffee in non-rhizosphere soil （T3） and homologous double-root coffee in non-rhizosphere soil （T4） were observed. The results indicated that compared with T2， the activity of SOD and MDHAR was significantly increased， and the content of DHA， GSSG， H2O2 and MDA was significantly decreased in T1. The oxidative damage of the heterologous double-root coffee was less than that of the homologous double-root coffee under the continuous cropping obstacle. There were no significant differences in H2O2 and MDA content in the leaves between T1 and T3 or T2 and T4， and the correlation between the evaluation indexes of the leaf oxidative damage and the indexes of plant antioxidant system was poor. The leaves were less sensitive to continuous cropping stress. There was significant difference in H2O2 content in roots between T1 and T3 or T2 and T4. There was no significant difference in MDA content between T1 and T3， but significant difference between T2 and T4. More root active oxygen species were produced under continuous cropping obstacle. The evaluation indexes of the root oxidative damage were very significant positively correlated with the content of DHA， GSH， GSSG， and very significant negatively correlated with the activity of SOD， POD， APX， GR， DHAR and MDHAR in roots. Also， the evaluation indexes of the root oxidative damage were significantly or very significantly positively correlated with the content of DHA， GSH， GSSG and the activity of POD， and significantly or very significantly negatively correlated with the activity of SOD， GR， MDHAR， AAO and DHAR in leaves. The root oxidative damage was affected by both the root and leaf antioxidant system. In summary， the roots of the homologous double-root coffee were more damaged by oxidation than those of the heterologous double-root coffee under the continuous cropping obstacle， and the root oxidative damage of the heterologous double-root coffee was alleviated by the root and leaf antioxidant system.

Keywords： coffee; continuous cropping obstacle; heterologous double-root; antioxidant enzyme; non-enzyme antioxidant

咖啡是我国热区重要的多年生优势特色作物[1-2]，然而，由于主栽品种中粒种咖啡连作栽培后根系细胞膜脂过氧化损伤严重，根系活力显著下降，极大地影响了咖啡产量，严重时甚至出现绝产、死株，连作障碍已成为咖啡种植业发展的最大限制因素[3-4]。针对连作障碍问题，茄子[5-6]、西瓜[7-9]等作物采用抗逆砧木嫁接主栽品种的方式改善根系生长状况，恢复植株长势。大粒种咖啡根系发达[10-11]，课题组前期研究也发现，以大粒种为砧木，中粒种为接穗的单砧嫁接苗，通过提高根系超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性，能有效清除连作障碍下诱导的过氧化氢（H2O2）等活性氧，减轻植株根系细胞膜氧化损伤，较中粒种自根嫁接苗，单砧嫁接苗根系丙二醛（MDA）含量显著下降，大粒种砧木表现出抗连作障碍优势[12]。

鉴于连作障碍咖啡园重新定植咖啡后，植株需要2～3年才能挂果，非生产期较长[1-2]，为此，尝试直接在园内中粒种上靠接大粒种砧木，形成的异源双根对恢复植株长势作用明显，这为减少多年生作物更新换代损失、快速恢复生产提供了新的思路。然而，异源双根靠接是否可以稳定地改善植株长势，及其缓解咖啡连作障碍的机制目前尚不清楚。因此，本研究以中粒种咖啡‘热研1号和大粒种咖啡1号靠接形成异源双根咖啡，利用连作障碍咖啡园土壤开展幼苗培养试验，通过测定植株叶片和根系的H2O2及MDA含量、抗氧化酶活性及非酶抗氧化物含量，探讨异源双根缓解咖啡连作障碍的机制，以期为优化异源双根靠接技术并推广应用提供理论支持。

1  材料与方法

1.1  材料

主栽品种中粒种咖啡‘热研1号和大粒种咖啡1号的种子经沙床催芽，待子叶平展时选取长势一致的幼苗，进行中粒种与大粒种、中粒种与中粒种靠接，保证靠接口离地位置相同。成活后均保留双根系，以保证2个供试材料根系量大体一致。地上部选留一条中粒种接穗，并在靠接口以上相同位置芽接‘热研1号高产无性系，解绑后选取长势一致，健壮的10月龄中粒种-大粒种异源双根咖啡和中粒种-中粒种同源双根咖啡作为试验材料。

1.2  方法

1.2.1  试验设计  试验于中国热带农业科学院香料饮料研究所人工气候室进行，以连作障碍咖啡园植株根际土、非根际土开展幼苗培养试验。试验包括4个处理：T1为异源双根咖啡在根际土中培养;T2为同源双根咖啡在根际土中培养;T3为异源双根咖啡在非根际土中培养;T4为同源双根咖啡在非根际土中培养。将幼苗移至装有5 kg土壤的营养钵中，淋足定根水，每个处理10盆，3次重复。土壤肥力特征见表1。培养过程中每隔2 d淋水1次，保持土壤湿润，控制荫蔽度50%、温度27 ℃左右，每隔90 d淋0.1%水溶肥（N-P-K：15-15-15）1次，浇灌量0.5 L/盆，其他管理按常规。培养前测定土壤肥力指标，培养1 a后分别取叶片和根系样，液氮速冻，?80 ℃保存，用于测定H2O2及MDA含量、抗氧化酶活性和非酶抗氧化物含量。

1.2.2  测定指标  （1）土壤肥力指标。参照鲍士旦[13]的方法分别测定根际土和非根际土pH、EC、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、钙、镁含量。

（2）H2O2及MDA含量。分别测定叶片和根系过氧化氢（H2O2）及丙二醛（MDA）含量，测定方法参照试剂盒说明书。

（3）抗氧化酶活性。分别测定叶片和根系超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸氧化酶（AAO）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性，测定方法参照试剂盒说明书。

（4）非酶抗氧化物含量。分别测定叶片和根系还原型抗坏血酸（AsA）、脱氢抗坏血酸（DHA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量，测定方法参照试剂盒说明书。

1.3  数据处理

采用Excel 2010软件进行试验数据的整理与分析，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，采用Duncans法进行多重比较。

2  结果与分析

2.1  异源双根对连作障碍下咖啡幼苗H2O2及MDA含量的影响

连作障碍咖啡园根际土培养后，异源双根咖啡较同源双根咖啡受氧化损伤影响小。较T2处理，T1处理植株H2O2及MDA含量在叶片中分别下降16.42%和46.84%，在根系中分別下降29.54%和47.67%，各指标处理间差异均达显著水平;连作障碍咖啡园非根际土培养后，较T4处理，T3处理植株H2O2及MDA含量在叶片中分别下降15.32%和26.31%，在根系中分别下降32.68%和20.64%，各指标处理间差异均达显著水平，与异源、同源双根咖啡在根际土中表现出的差异相似。在根际土和非根际土中，异源双根咖啡或同源双根咖啡的叶片H2O2及MDA含量差异均不显著;根系H2O2含量差异显著，MDA含量在异源双根咖啡的2个处理间差异不显著，在同源双根咖啡的2个处理间差异显著。T1、T3处理间，或T2、T4处理间植株叶片各指标差异均不显著，连作逆境未加重植株叶片氧化损伤;T3较T1处理，或T4较T2处理植株根系H2O2含量均差异显著，降幅分别为41.68%和38.96%，根系MDA含量在T1、T3处理间差异不显著，而T4较T2处理显著下降，降幅为23.36%，连作逆境使植株根系产生较多的活性氧，并且对同源双根咖啡的氧化损伤较大（表2）。

2.2  异源双根对连作障碍下咖啡幼苗抗氧化酶活性的影响

连作障碍咖啡园根际土培养后，异源双根咖啡较同源双根咖啡抗氧化酶活性高。较T2处理， T1处理植株叶片SOD、CAT、MDHAR活性均显著提高，增幅分别为719.47%、52.05%和656.21%，其余叶片指标处理间差异均不显著，根系SOD、CAT、MDHAR、APX活性均显著提高，增幅分别为216.37%、59.84%、1560.00%和74.70%，其余根系指标除AAO外，处理间差异均不显著;连作障碍咖啡园非根际土培养后，较T4处理，T3处理植株叶片SOD、POD、CAT、APX活性均显著提高，增幅分别为64.18%、60.07%、45.38%和37.78%，其余叶片指标除AAO、GR外，处理间差异均不显著，根系中除GR外，其余指标T3较T4处理均显著提高，与根际土培养结果相似，异源双根咖啡较同源双根咖啡表现出更高的抗氧化酶活性。较根际土，经非根际土培养后，同源双根咖啡叶片、根系，及异源双根咖啡根系的抗氧化酶活性均较高，而异源双根咖啡叶片抗氧化酶活性趋势不明显。较T2处理，T4处理植株叶片SOD、AAO、MDHAR、GR、DHAR活性，及根系SOD、POD、MDHAR、APX、GR、DHAR活性均显著提高，与2个处理植株氧化损伤程度的趋势相反。较T1处理，T3处理植株根系SOD、POD、AAO、APX、GR、DHAR活性，及叶片AAO、APX、GR、DHAR活性均显著提高，而叶片SOD、POD、CAT、MDHAR活性显著下降，总体来说，与2个处理植株根系氧化损伤程度的趋势相反（表3）。

2.3  异源双根对连作障碍下咖啡幼苗非酶抗氧化物含量的影响

较T2处理，T1处理植株叶片、根系的DHA、GSH、GSSG含量均显著下降，AsA含量在叶片显著下降，在根系显著提高，较T4处理，T3处理植株叶片、根系的AsA含量显著提高，其余指标在处理间差异均不显著，异源双根咖啡和同源双根咖啡的非酶抗氧化物经根际土或非根际土培养后变化趋势较一致，而作用趋势不同。较T3处理，T1处理植株叶片AsA含量显著下降，GSSG含量显著提高，DHA、GSH含量处理间差异不显著，较T4处理，T2处理植株叶片GSH、GSSG含量显著提高，AsA、DHA含量处理间差异不显著。T1较T3处理，或T2较T4处理植株根系非酶抗氧化物各指标含量均显著提高，异源双根咖啡或同源双根咖啡的非酶抗氧化物经根际土和非根际土培养后变化趋势较一致，而作用趋势不同（表4）。

2.4  氧化损伤评价指标和抗氧化系统各指标的相关性分析

叶片的H2O2含量与DHA含量显著正相关，与SOD活性极显著负相关，与POD、CAT、AAO、MDHAR、APX、GR、DHAR活性及MDA、AsA、GSH、GSSG含量相关性均不显著;叶片的MDA含量与SOD、CAT、MDHAR活性极显著负相关，与POD、AAO、APX、GR、DHAR活性及AsA、DHA、GSH、GSSG含量相关性均不显著。根系的H2O2含量与MDA含量显著正相关，与DHA、GSH、GSSG含量极显著正相关，与SOD、POD、APX、GR、DHAR活性极显著负相关，与CAT、AAO、MDHAR活性及AsA含量相关性不显著;根系的MDA含量与GSH含量显著正相关，与MDHAR、APX活性极显著负相关，与SOD、POD、CAT、AAO、GR、DHAR活性及AsA、DHA、GSSG含量相关性不显著（表5）。

叶片H2O2含量与根系的H2O2含量显著正相关，与DHA含量极显著正相关，与SOD活性显著负相关，与MDHAR、APX活性极显著负相关;叶片MDA含量与根系的MDA含量极显著正相关，与MDHAR活性极显著负相关。根系H2O2含量与叶片的POD 活性及H2O2、DHA含量显著正相关，与GSH、GSSG含量极显著正相关，与SOD、GR活性显著负相关，与AAO、DHAR活性极显著负相关;根系MDA含量与叶片的DHA、GSH含量显著正相关，与H2O2、MDA含量极显著正相关，与SOD、MDHAR活性极显著负相关。连作障碍下植株根系较叶片更为敏感，根系氧化损伤不仅与根系抗氧化系统密切相关，还受到叶片抗氧化系统的影响（表5）。

3  讨论

膜脂过氧化损伤是植物在逆境下较为普遍的生理效应[14-19]。Melchiorre等[15]认为在正常情况下，细胞内H2O2等活性氧的产生和清除处于动态平衡，H2O2等含量较低，从而免遭氧化损伤。而在逆境胁迫下，H2O2大量积累，致使细胞膜脂过氧化水平加剧，MDA含量升高，同时，植株抗氧化系统参与清除活性氧，抗性品种表现为使植株免受氧化损伤或受损伤影响小，类似结论在辣椒低温胁迫[17]、龙葵镍胁迫[18]等研究中均有报道。本研究发现，相比中粒种-中粒种同源双根咖啡，中粒种-大粒种异源双根咖啡在连作障碍咖啡园根际土和非根际土中受氧化损伤的影响均较小。根际土培养后，异源双根咖啡T1处理较同源双根咖啡T2处理植株SOD、MDHAR等抗氧化酶活性显著提高，DHA、GSSG等非酶抗氧化物含量显著下降;非根际土培养后，异源双根咖啡T3处理较同源双根咖啡T4处理植株SOD、POD等抗氧化酶活性显著提高，在2种土培条件下，异源双根咖啡H2O2及MDA含量均显著下降，植株抗氧化能力强。干旱胁迫下，构树通过增加叶片SOD、POD等酶活性减轻氧化损伤，SOD、POD在胁迫后第14天活性最高，酶活性在整个胁迫过程中呈先升高后下降的变化趋势[20]。异源双根咖啡在连作逆境中表现出的生长优势，是因为植株本身抗氧化能力强，还是在连作逆境中抗氧化系统进一步发生变化所致，还需分期取样确定。

抗氧化系统有清除活性氧的生理功能，然而，关于逆境胁迫对植物抗氧化系统影响的结论却不尽相同，这可能与植物种类、逆境类型、胁迫程度等有关[21-25]。铅铬复合胁迫后小麦CAT活性升高，铅铬单一胁迫后POD和SOD活性升高[21];轻度干旱胁迫后，中粒种咖啡幼苗叶片SOD、POD、CAT活性极显著升高，MDA含量无显著变化，但中度或重度干旱胁迫后，酶活性极显著下降，MDA含量显著升高[22]。在根際土和非根际土中，异源双根咖啡T1、T3处理间，或同源双根咖啡T2、T4处理间，植株叶片H2O2及MDA含量差异均不显著，连作逆境未加重植株叶片氧化损伤。相关性分析也发现，叶片氧化损伤评价指标除了与DHA含量显著正相关，与SOD、CAT、MDHAR活性极显著负相关，与其他指标相关性均不显著，因此判断咖啡叶片对连作逆境较不敏感。根系H2O2含量在T1、T3处理间，或T2、T4处理间差异显著，而MDA含量在T1、T3处理间差异不显著，在T2、T4处理间差异显著，连作逆境使植株根系产生较多的活性氧，并且对同源双根咖啡根系的氧化损伤较大。通过相关性分析发现，咖啡根系氧化损伤评价指标与根系DHA、GSH、GSSG含量极显著正相关，与SOD、POD、APX、GR、DHAR、MDHAR活性极显著负相关，并且，与叶片DHA、GSH、GSSG含量及POD活性显著或极显著正相关，与SOD、GR、MDHAR、AAO、DHAR活性显著或极显著负相关，咖啡根系氧化损伤不仅与根系抗氧化系统密切相关，还受到叶片抗氧化系统的影响。综上所述，在连作障碍条件下，同源双根咖啡根系受氧化损伤大，异源双根咖啡通过根系及叶片抗氧化系统共同缓解根系氧化损伤，具体是因为异源的大粒种根系在起作用，还是双根间的相互作用，有待进一步分根取样明确。

参考文献

中国热带农业科学院， 华南热带农业大学. 中国热带作物栽培学[M]. 北京： 中国农业出版社， 1998： 438-439.

孙  燕， 龙宇宙. 咖啡栽培技术[M]. 北京： 中国农业出版社， 2016： 1-3.

Zhao Q Y， Xiong W， Xing Y Z， et al. Long-term coffee monoculture alters soil chemical properties and microbial communities[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 6116-6126.

孫  燕， 董云萍， 龙宇宙， 等. 种间嫁接对连作障碍土壤上咖啡生长及养分吸收特性的影响[J]. 热带农业科学， 2019， 39（8）： 5-10.

陈绍莉， 周宝利， 尹玉玲， 等. 茄子自毒物质胁迫下嫁接对其生长及土壤生化特性的影响[J]. 园艺学报， 2010， 37（6）： 906-914.

魏国平. 耐盐砧木嫁接提高茄子耐硝酸钙的生理机制[D]. 南京： 南京农业大学， 2009.

Colla G， Rouphael Y， Cardarelli M， et al. The effectiveness of grafting to improve alkalinity tolerance in watermelon[J]. Environmental and Experimental Botany， 2010， 68（3）： 283-291.

孟佳丽， 吴绍军， 余  翔， 等. 不同类型砧木对西瓜连作障碍消减的影响[J]. 西北农业学报， 2019， 28（7）： 1110- 1118.

阳燕娟， 郭世荣， 于文进， 等. 嫁接对盐胁迫下西瓜幼苗体内离子和内源激素含量与分布的影响[J]. 西北植物学报， 2015， 35（3）： 500-507.

江  梅. 不同土壤条件下中粒种和大粒种咖啡的根系活动类型[J]. 世界热带农业信息， 1994（4）： 14.

闫  林， 董云萍， 黄丽芳， 等. 咖啡种间嫁接与不嫁接植株主要农艺和品质性状比较[J]. 热带作物学报， 2019， 40（7）： 1253-1258.

孙  燕， 杨建峰， 董云萍， 等. 咖啡根系分泌物对嫁接后植株生长及叶片保护酶活性的影响[J]. 生态学杂志， 2017， 36（5）： 1310-1314.

鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 3版， 北京： 中国农业出版社， 2000.

Fridovich I. The biology of oxygen radicals[J]. Science， 1978， 201： 875-880.

Melchiorre M， Robert G A N， Trippi V， et al. Superoxide dismutase and glutathione reductase overexpression in wheat protoplast： Photooxidative stress tolerance and changes in cellular redox state[J]. Plant Growth Regulation， 2009， 57（1）： 57-68.

陈  月， 孙宪芝， 杨景慧， 等. 水分胁迫下嫁接对杭白菊渗透调节物质及相关代谢酶基因表达的影响[J]. 植物生理学报， 2018， 54（5）： 895-903.

Airaki M， Leterrier M， Mateos R M， et al. Metabolism of reactive oxygen species and reactive nitrogen species in pepper （Capsicum annuum L.） plants under low temperature stress[J]. Plant Cell and Environment， 2012， 35（2）： 281-295.

Soares C， Sousa A D， Pinto A， et al. Effect of 24-epibrassinolide on ROS content， antioxidant system， lipid peroxidation and Ni uptake in Solanum nigrum L. under Ni stress[J]. Environmental and Experimental Botany， 2016， 122（2）： 115-125.

Pinheiro H A， Da Matta F M， Chaves A R M， et al. Drought tolerance in relation to protection against oxidative stress in clones of Coffea canephora subjected to long-term drought[J]. Plant Science， 2004， 167（6）： 1307-1314.

吴永波， 叶  波. 高温干旱复合胁迫对构树幼苗抗氧化酶活性和活性氧代谢的影响[J]. 生态学报， 2016， 36（2）： 403-410.

杨文玲， 巩  涛， 刘莹莹， 等. 铅铬胁迫对小麦幼苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响[J]. 中国农学通报， 2015， 31（6）： 45-50.

杨华庚， 颜速亮， 陈慧娟， 等. 干旱胁迫对中粒种咖啡幼苗膜脂过氧化、抗氧化酶活性和渗透调节物质含量的影响[J]. 热带作物学报， 2014， 35（5）： 944-949.

李  华. 嫁接对Cu胁迫下黄瓜幼苗生理生化指标和根系分泌物的影响[D]. 泰安： 山东农业大学， 2015.

周建朝， 林晓坤， 王孝纯， 等. 低磷胁迫对不同基因型甜菜抗性生理特征的效应[J]. 植物营养与肥料学报， 2010， 16（6）： 1379-1386.

Jamil M， Rha E S. NaCl stress-induced reduction in growth， photosynthesis and protein in mustard[J]. Journal of Agricultural Science， 2013， 5（9）： 114-127.

责任编辑：谢龙莲