烟草黑胫病拮抗链霉菌筛选及田间防效试验

邹朔飞 董祥立 李继业 丁海霞 李治模

摘 要：筛选用于防治烟草黑胫病的拮抗链霉菌，并可作为化学药剂补充或替代品。采用稀释平板法分离土壤链霉菌，采用平板对峙法筛选拮抗链霉菌，通过形态观察、生理生化试验及16S rRNA序列分析鉴定目标菌株，通过田间小区试验评价目标菌株的生防潜力和对烤烟的促生效果。从贵州省湄潭县采集烤烟根际土壤，分离到放线菌73株。从中筛选获得1株对烟草黑胫病菌拮抗效果良好的菌株MT35，该菌鉴定为郝氏链霉菌（Streptomyces halstedii）。结果表明，施用MT35后烟株茎围、茎高和叶宽均有增加，对烟草黑胫病的防效良好，相对防效为 75.3%。筛选到1株对烟草黑胫病菌有强拮抗作用的郝氏链霉菌（S. halstedii）MT35，该菌对烟草黑胫病具有良好的田间防效且对烟株具有促生效果。

关键词：烟草黑胫病;生物防治;链霉菌

中图分类号：Q935

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2021）02-0049-05

国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.02.008

Abstract：Tobacco black shank is one of the most serious diseases of tobacco in Guizhou，China. An antagonistic Streptomyces strain against Phytophthora nicotianawas isolated from soils，which could be used as a supplement or substitute for chemical agents.Antagonistic strain were isolated by the dilution plate method and thedual-culture test. The target strains were identified based on morphology，physiological and biochemical experiments and 16S rRNA sequence analysis. The biocontrol potential and growth-promotion effect of the target strain were evaluated by fieldtrials.The results showed that 73 strainsofStreptomyceswere isolated from the soil samples of healthy tobacco rhizosphere in Meitan County，Guizhou province.OneStreptomyces strainnamed MT35 with obvious antagonism effect on tobacco black shankwas obtained from the screening，and which was identified as Streptomyces halstedii. The results of field experiments showed that MT35existedobvious control effects on tobacco black shank，witha relativecontrol effect of 75.3%.The stem circumference，stem height and leaf width oftobacco were increased significantly afterapplying MT35.Streptomyces halstediiMT35 with distinctively antagonismtoPhytophthora nicotianawas isolated and characterized，which hadwell biocontrol effect and growth-promoting effecton tobacco plants in field trail.

Keywords：Tobacco black shank;biocontrol;Streptomyces

烟草黑胫病是由烟草疫霉（Phytophthora nicotiana）引起的毁灭性病害[1]，该病在全世界40余个国家和地区都有发生，分布非常廣泛[2]。烟草黑胫病在我国各个烟区均有发生，贵州省是我国烟草的主要栽培地之一，长期种植烤烟导致该病发病率逐年上升，严重影响烟叶品质和农民收入[3]。目前生产上主要使用化学药剂防治且有较好的效果，但化学药剂的使用伴随着严峻的“3R”问题，病原菌的抗药性逐年增加，田间用药量逐年上升，因此对环境友好的生物防治已成为研究热点[4-5]。使用放线菌，尤其是链霉菌（Streptomyces），防治植物病害一直是国内外生物防治研究的热门领域。链霉菌可产生多种抗生素类物质和植物激素等，可以提高植物抗病和抗逆性，并具有拮抗作用、竞争作用、诱导抗性和促生作用等多种生防作用机制，具有良好的生物农药开发潜力[6]。我国开发的由吸水链霉菌井冈变种产生的井冈霉素，已成功用于水稻纹枯病的防治，此外宁南霉素、农抗120、中生菌素和多抗霉素等由链霉菌产生的抗生素作为低毒、低残留生物农药均得到广泛应用[7-8]。本研究从贵州省湄潭县烤烟种植地块采集健康植株根际土壤，分离筛选具防治烟草黑胫病生防潜力的放线菌，并进行田间小区防效试验，为筛选作为化学药剂补充或替代品的拮抗链霉菌和开发适合贵州省烟草病害的生防链霉菌制剂提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株与烤烟品种

烟草黑胫病菌（P. nicotiana）由贵州大学农学院植物病理学教研室提供。田间小区试验品种为云烟87。

1.1.2 供试培养基

高氏1号培养基用于分离和培养放线菌。PDA用于平板对峙试验[9]。

1.1.3 供试药剂

对照药剂为30%甲霜·噁霉灵水剂：武汉久农作物保护有限公司，甲霜灵6%，噁霉灵24%。

1.2 方法

1.2.1 土壤链霉菌分离及筛选

于2017年4—6月从贵州省湄潭县抄乐镇（N27°45′7.76″，E107°27′39.91″）采集烟草黑胫病发病田块的健康烤烟根际土壤样品9份，土壤样品采集后立刻带回实验室置于阴凉通风处风干，采用稀释平板法分离放线菌[9-10]。

1.2.2 烟草黑胫病拮抗放线菌筛选

采用平板对峙法筛选拮抗烟草黑胫病菌效果明显的放线菌，通过初筛和复筛观察是否产生抑菌圈，十字交叉法测量其抑菌直径，采用DPS对其抑制率数据进行分析[9]。

抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

1.2.3 拮抗放线菌形态学鉴定

在高氏1号培养基平板上划线培养菌株，30 ℃培养7 d观察菌落形态。

1.2.4 拮抗放线菌分子生物学鉴定

用50 mg/mL溶菌酶37 ℃水浴1 h处理菌体后，Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒对菌株基因组DNA进行提取。以基因组DNA为模板，采用16S rRNA 通用引物27F/1492R[11]进行PCR扩增，PCR产物验证正确后送上海生工进行PCR产物测序。测序结果于NCBI数据库进行BLAST比对分析，并利用CLUSTAL X软件进行多序列比对和系统进化分析软件MEGA6中的最大似然法（ML）构建系统发育树[11]，建树链霉菌种及序列号见表1。

1.2.5 拮抗放线菌生理生化特征测定

参考Evangelista链霉菌生理生化特性鉴定的改良方法[11]，对菌株的生理生化特性进行测定。

1.2.6 田间防治试验

试验方案：2018年4月，在贵州省湄潭县湄凤余科技园选取上年度烟草黑胫病发生严重的地块进行试验。选择复筛抑菌效果好的1株放线菌，设3个处理。处理1，清水对照（CK）;处理2，30%甲霜·噁霉灵水剂;处理3，放线菌MT35。每处理30株烟，重复4次。小区采用随机区组排列，行距110 cm、株距55 cm。从烟苗移栽后开始施用药剂。30%甲霜·噁霉灵水剂按推荐剂量施用3次，第1次将药剂溶于定根水中灌根，之后药剂稀释后灌根。放线菌施用4次，放线菌孢子悬浮液浓度为5×105 CFU/mL，50 mL/株;第1次在移栽时和定根水一起施用，第2次施药在移栽后10 d，第3次施药在移栽后25 d，第4次施药在移栽后40 d。其他田间管理措施与当地烤烟生产管理措施一致。

农艺性状调查：2018 年 7月，依据YC/T142-2010烟草农艺性状调查测量方法调查烟株农艺性状，每小区选5株代表该小区长势且生长一致的烟株为定株，测量茎高、茎围、最大叶长和最大叶宽，于团棵期、旺长期和打顶后分别调查1次，共调查3次。

田间病害发生情况调查：田间病害发生情况调查在烟株打顶后进行。病害分级标准依据GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法，每小区调查所有烟株，记录发病烟株数量，依据病害分级标准记载烟株发病程度，计算发病率和病情指数[9]。

发病率=（发病株数/调查总株数）×100%

病情指数=∑（各级病株或叶数×该病级值）/（调查总株或叶数×最高级值）×100

相对防效=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数×100%

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌筛选

从9份烤烟根际土壤中分离到放线菌73株。经初筛与复筛（图1、图2），1株编号为MT35的放线菌对烟草黑胫病菌抑制率最高，为88.46%。

2.2 放线菌鉴定

2.2.1 形态学鉴定

MT35菌株基内菌丝灰色，气生菌丝白色至灰白色，不产生可溶性色素，孢子丝直，孢子表面光滑，培养基上生长呈放射状。

2.2.2 生理生化鉴定

生理生化鉴定结果见表2，菌株MT35可产纤维素酶，不产明胶、淀粉水解酶、氧化酶、硫化氢和黑色素，不能利用木糖。

2.2.3 分子生物学鉴定

选取菌株MT35 16S rRNA序列，进行 Nucleotide BLAST 比对，发现与郝氏链霉菌Streptomyces halstedii NRRL B-1238T （登录号： EF178695）同源性高达99%。基于以上比对分析，可初步鉴定菌株MT35为郝氏链霉菌（S. halstedii），在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下载相关菌种对应序列构建系统发育树（图 4），结果显示：MT35以 98%的支持率与 S. halstedii 聚为一支，16S rRNA基因序列已提交GenBank数据库，序列号为MW297792。综合形态学、生理生化特性和分子生物学鉴定结果，将菌株MT35鉴定为郝氏链霉菌（S. halstedii）。

2.3 田间小区试验农艺性状调查

烟株农艺性状调查结果见表3。结果表明，团颗期烟株经MT35处理较CK和30%甲霜·噁霉灵水剂能显著促进烟株茎围的增长;旺长期MT35處理较CK和30%甲霜·噁霉灵水剂能显著促进烟株茎高的增长;打顶后MT35处理后烟株的茎高、茎围和叶宽对比CK和30%甲霜·噁霉灵水剂有明显的增长，表明施用MT35对烟株生长有一定的促进作用。

2.4 防治烟草黑胫病田间小区试验

MT35对烟草黑胫病田间防治试验结果见表4，结果表明，施用MT35的田块对烟草黑胫病的防效和30%甲霜·噁霉灵水剂的防效相当，达到75.3%。

3 结论与讨论

本研究从贵州省湄潭县烟草黑胫病发病烟田健康烟株根际土壤中分离放线菌，得到了1株在室内拮抗效果良好的菌株MT35，通过田间防治试验表明MT35对烟草黑胫病表现出了良好防治效果，相对防效为75.3%，与生产中常用化学药剂30%甲霜·噁霉灵水剂的防效相当。此外，施用MT35的烟株茎高、茎围和叶宽均有显著增加，表明MT35对大田烟草的生长产生了促进的作用。通过形态学、生理生化特性和分子生物学对MT35进行鉴定，该菌为郝氏链霉菌（S. halstedii）。

链霉菌可分泌植物生长调节剂类物质如IAA、嗜铁素等对植物生长产生促进作用，可分泌多种抗生素和胞外水解酶如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶等可对植物病原菌活性起到抑制作用，此外内生链霉菌也可通过诱导植物系统抗性来激活植物的防御反应抑制病害[6-8，10]。链霉菌作为生防菌在大田等复杂环境中成功实现产品生防效果的报道还相对较少[12-14]，作为生防药剂或化学药剂补充剂，配合化学药剂施用，对于农业上减少化学药剂的使用方面具有良好应用前景。MT35在室内和大田均表现出良好的抑菌和防病效果，并对大田烟草产生促生作用，下一步可对MT35的代谢产物进行研究，深入了解其生防机制，为MT35的田间应用提供研究基础。

参 考 文 献：

[1] 易龙，邱妙文，陈永明，等.烟草黑胫病的生物防治研究进展[J].中国农学通报，2017，33（25）：146-151.

[2] 高亚星.烟草黑胫病防治技术研究[D].贵阳：贵州大学，2017.

[3] 方敦煌，肖炳光，童治军，等.一种预测土壤中烟草黑胫病发病潜力的方法[J].西南农业学报，2017，30（10）：2246-2250.

[4] 余水，丁海霞，罗玉英，等.贝莱斯芽孢杆菌MT310生防机制初探[J].山地农业生物学报，2020，39（5）：23-28.

[5] LUCAS G B. Disease of Tobacco[M].New York：Scarecrow Press Inc.，1958.

[6] 易龙，张亚，廖晓兰，等.链霉菌防治植物病害的研究进站[J].江苏农业科学，2014，42（3）：91-95.

[7] 李凱，袁鹤.植物病害生物防治概述[J].山西农业科学，2012，40（7）：807-810.

[8] 朱志炎，田志宏，李建雄.链霉菌的功能及其在农业上的应用[J].热带亚热带植物学报，2019，27（5）：580-590.

[9] 方中达.植病研究方法[M].3版.北京：中国农业出版社，2007.

[10] 王世强.链霉菌JD211对水稻的防病促生效应及机制[D].南昌：江西农业大学，2014.

[11] EVANGELISTA-MARTNEZ Z.Isolation and characterization of soil Streptomyces species as potential biological control agents against fungal plant pathogens[J].World Journal of Microbiology Biotechnology，2014，30（5）：1639-1647.

[12] 丁芮涵，李立梅，刘庆珍，等.蓝莓溃疡病生防链霉菌CX3的抑菌效果及其鉴定[J].农药，2020，59（4）： 308-312.

[13] 圆圆，张虹，苏道拉呼，等.抑制黄瓜枯萎病的链霉菌S-101及其生防作用研究[J].中国生物防治学报，2019，35（5）：813-820.

[14] 朱志炎，田志宏，李建雄.链霉菌的功能及其在农业上的应用[J].热带亚热带植物学报，2019，27（5）：580- 590.