副猪嗜血杆菌对小鼠的致病性探究及感染模型的建立
2021-08-06宋晓明李佃场林佳旭张洪亮秦晓冰
宋晓明,李佃场,林佳旭,宋 杰,王 森,张洪亮,秦晓冰,单 虎
(1.青岛农业大学动物医学院,山东省新兽药创制协同创新中心,山东青岛 266109;2.乳山市行政审批服务局,山东乳山 264500 3.即墨区畜牧业发展服务中心,山东青岛 266200)
副猪嗜血杆菌病,又称格拉塞尔氏病,是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)引起的,以猪的多发性浆膜炎、纤维素性胸膜炎、脑膜炎、腹膜炎、心包炎和关节炎等多器官病变为特征的细菌性传染病[1-2]。该病在各年龄段猪群中均有发生,断奶和保育仔猪比较易感,5~8 周龄仔猪发病率为10%~15%,发病严重的养殖场死亡率达50%以上。该病呈世界性分布,危害范围较广。目前猪群病原复杂多变,病毒与细菌多病原混合感染情况严重,HPS 作为一种主要的继发病原,给国内外养猪业带来较大经济损失[3-5]。
根据琼脂扩散(kieletein-rapp-gabriedson,KRG)血清分型方法,HPS 可分为15 种血清型[6-7]。不同地区流行的HPS 血清型不同,菌株间毒力差异较大。在我国,主要流行血清4 型、5 型、12 型和13 型菌株。因血清4 型、5 型在我国流行分布范围最广,毒力较强,因此多被选作HPS 感染模型最适菌株[8-11]。从现有研究进展来看,该菌致病机理较为复杂,因此建立一种成本低且稳定可靠的感染动物模型对于HPS 研究至关重要。
本试验对HPS 血清4 型、5 型的6 种菌株进行昆明系(KM)小鼠致病性分析,选取最适菌株最适剂量对小鼠进行腹腔注射,将死亡小鼠的临床症状、病理变化与HPS 猪体试验进行对比,然后进行细菌分离鉴定、PCR 鉴定,建立KM 小鼠感染模型。
1 材料与方法
1.1 菌株
从山东、河北、福建、广东、江西5 省分离到的6 株HPS,编号分别为SD-05、ZC-7、ND-21、BD-1、HB-08、PZ-26。经KRG 血清型鉴定,SD-05、ZC-7 和ND-21 分离菌株为血清4 型,BD-1、HB-08、PZ-26 分离菌株为血清5 型。上述菌株均由本实验室鉴定、保管和备用。
1.2 试验动物
体质量16~20 g 的KM 雌性清洁级小鼠400 只,购自青岛派特福德白鼠养殖专业合作社。经检测确认,KM 小鼠HPS 抗体均呈阴性。
1.3 材料与试剂
胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB),购自英国OXOID 公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),购自Sigma 公司;新生牛血清,购自浙江天杭生物科技有限公司;DL 1 000 DNA Marker、ExTaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture,购自宝日医生物技术(北京)有限公司。
1.4 HPS 对KM 小鼠毒力测定
1.4.1 血清4 型、5 型分离株复苏培养 将HPS血清4 型(SD-05、ZC-7、ND-21)、5 型(BD-1、HB-08、PZ-26)分离株分别在添加有0.005% NAD和5%新生牛血清的TSA 固体培养基上复苏,连续传至第3 代;无菌条件下挑取单菌落至5 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液体培养基中,37 ℃、180 r/min 培养10~12 h,作为种子液;将种子液按照2%接种量接种至100 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液体培养基中,37 ℃、180 r/min 扩大培养10~12 h;应用平板菌落计数法进行活菌计数,再将菌液稀释成5 个梯度剂量,对KM 小鼠进行毒力测定。
1.4.2 血清4 型、5 型分离株毒力测定 对于每种分离株,选取60 只KM 小鼠开展试验。将小鼠随机分为6 组,每组10 只。前5 组为试验组,每种分离株以不同剂量对小鼠腹腔注射,0.2 mL/只;第6组为对照组,腹腔注射同等剂量PBS,观察60 h。记录小鼠死亡数,根据毒力测定结果分别选取血清4 型、5 型毒力较强菌株用于KM 小鼠攻毒试验。
1.5 KM 小鼠攻毒试验
1.5.1 血清4 型菌株 选取20 只KM 小鼠开展试验,将小鼠随机平均分为2 组(试验A 组、对照A 组)。以最适剂量对试验A 组小鼠腹腔注射1.4.2 中选出的HPS 血清4 型菌株,0.2 mL/只,对照A 组腹腔注射同等剂量PBS。
1.5.2 血清5 型菌株 选取20 只KM 小鼠开展试验,将小鼠随机平均分为2 组(试验B 组、对照B 组)。以最适剂量对试验B 组小鼠腹腔注射1.4.2 中选出的HPS 血清5 型菌株,0.2 mL/只,对照B 组腹腔注射同等剂量PBS。
1.6 病理变化
观察记录感染后小鼠的临床变化,当试验组小鼠死亡后,进行病理剖检,观察主要器官病理变化情况。
1.7 细菌学鉴定
无菌条件下采集死亡小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、心血、腹腔积液、胸腔积液等组织病料,接种于添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSA、TSB 培养基中,37 ℃培养24~48 h,挑取疑似单菌落,进一步纯化培养。
1.8 PCR 鉴定
根据GenBank 中HPS 16s rRNA 基因序列(登录号:M75065)设计引物(上游引物:5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3';下游引物:5'-GGCTTCGTCACCCTCTGTA-3')。预计扩增目的片段大小为822 bp,引物送北京赛百盛基因技术有限公司合成。采用25.0 µL PCR 反应体系(表1)。反应条件:预变性94 ℃ 5 min;变性94 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,循环30 次;终延伸72 ℃ 10 min。根据文献[12]方法对分离菌株进行PCR 鉴定。
表1 PCR 反应体系 单位:µL
2 结果
2.1 不同分离菌株对KM 小鼠毒力测定
2.1.1 血清4 型分离菌株毒力测定 从表2~4 可以看出,尽管3 个菌株均为血清4 型,但使用不同菌株注射小鼠后,小鼠死亡情况不同。当腹腔注射剂量达到(1.1~1.3)×1010CFU 时,SD-05 株可使小鼠在48 h 内全部死亡,ZC-7 株可使80%小鼠死亡,而ND-21 株毒力最弱,只能使60%小鼠死亡。因此推测血清4 型SD-05 株毒力较强。
表2 血清4 型分离菌株SD-05 对KM 小鼠毒力测定结果
表3 血清4 型分离菌株ZC-7 对KM 小鼠毒力测定结果
表4 血清4 型分离菌株ND-21 对KM 小鼠毒力测定结果
2.1.2 血清5 型分离菌株毒力测定 从表5~7 可以看出,尽管3 个菌株均为血清5 型,但使用不同菌株注射小鼠后,小鼠死亡情况不同。当腹腔注射剂量达到(1.1~1.2)×1010CFU 时,HB-08 株可使小鼠在48 h 内全部死亡,PZ-26 株可使80%小鼠死亡,而BD-1 株只能使50%小鼠死亡。因此推测血清5 型HB-08 株毒力较强。
表5 血清5 型分离菌株BD-1 对KM 小鼠毒力测定结果
表6 血清5 型分离菌株HB-08 对KM 小鼠毒力测定结果
表7 血清5 型分离菌株PZ-26 对KM 小鼠毒力测定结果
2.2 攻毒后临床表现
为保证建立的小鼠感染模型中同时有发病病例和死亡病例,分别使用1.2×109CFU 剂量的血清4 型SD-05 株、1.175×109CFU 剂量的血清5型HB-08 株对小鼠开展攻毒试验。3 h 后,试验A、B 两组小鼠开始出现颤抖、呼吸急促、精神不振、萎靡厌食、拥挤扎堆、背毛凌乱站立等临床症状;24 h 后小鼠开始死亡,持续至攻毒60 h 后不再出现新增死亡小鼠。对照A、B 组小鼠均表现正常。
2.3 剖检变化
试验A、B 组小鼠死亡后的剖检观察发现,死亡小鼠心脏、肺脏出血,脾脏出血、肿大,肝脏有出血点、肿大,胸腔积液,肠道肿大、透明(图1)。
图1 HPS 攻毒60 h 后小鼠剖检变化
2.4 PCR 鉴定
经PCR 扩增,成功鉴定到长度约822 bp 的HPS 目的条带(图2),与预期片段大小一致。
图2 死亡小鼠组织样品PCR 鉴定结果
3 分析与讨论
HPS 常发生于饲养环境差的小型养猪场,给养殖户造成了巨大经济损失。国内外学者对HPS致病性、毒力和免疫原性的研究从未停止。猪是研究HPS 最好的试验动物模型,但普通猪常存在母源抗体影响。为避免这种情况,研究人员采用SPF 猪、初乳缺乏猪[13]、剖腹产初乳缺乏猪[14]、普通断奶仔猪等作为HPS 感染试验动物,成功复制了典型HPS 病例。SPF 猪等虽然可以作为理想的HPS 动物模型,但存在试验条件要求较高、成本高等问题,导致其在实际研究应用中存在局限性。当HPS 致病性研究需要大量试验动物时,寻求猪的替代感染动物显得尤为重要,如小鼠和豚鼠等。
本试验以HPS 血清4 型(SD-05、ZC-7、ND-21)、5 型(BD-1、HB-08、PZ-26)分离株为研究对象,对KM 小鼠进行毒力测定。结果显示:6种分离株均对小鼠有一定致病性,但不同血清型菌株以及相同血清型不同菌株,对KM 小鼠毒力及致病性也不同。其中,血清4 型SD-05 株和血清5型HB-08 株毒力较强,小鼠发病及死亡率较高,具有更强的致病性。
综合毒力测定结果,选择毒力和致病性较强、遗传特性稳定的血清4 型分离菌株SD-05 和血清5型分离菌株HB-08 作为建立HPS 血清4 型、5 型KM 小鼠感染模型的感染菌种。KM 小鼠攻毒试验中,采用SD-05株和HB-08株对小鼠进行腹腔接种,对死亡小鼠的临床症状表现、剖检变化及细菌分离鉴定结果进行分析总结。攻毒后小鼠出现颤抖、呼吸急促、精神萎靡、厌食消瘦、拥挤扎堆、背毛凌乱等情况,与猪格拉塞尔氏病具有相似临床症状;剖检发现肺脏出血及炎性变化、胸腔积液、心脏病变且伴有血凝块、胸腔轻微黏连、肝脏肿大等情况,与猪格拉塞尔氏病具有相似病理变化;通过细菌分离培养,在小鼠组织器官中分离得到HPS 菌株。研究表明,HPS 对KM 小鼠具有致病性,4 型、5型菌株不仅能够引起小鼠发病死亡,且毒力较强。综上,本试验初步建立了血清4 型、5 型副猪嗜血杆菌的小鼠感染模型,可用于研究HPS 毒力和免疫原性相关因子,为HPS研究发展奠定了应用基础。