葡萄牙使用非洲猪瘟弱毒疫苗的历史案例分析

戈胜强，韩乃君，吕 艳，任炜杰，张潇月，王勤玉，南文龙，吴晓东，王志亮

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.山东农业大学，山东泰安 271001）

在面对大范围传播的烈性传染病时，疫苗免疫接种是最有效的防控手段之一。但大规模疫苗（特别是弱毒活疫苗）接种又会带来一些负面担忧，如疫苗毒重组导致毒力返强，免疫压力导致流行株变异等。非洲猪瘟（African swine fever，ASF）自1921 年公开报道以来，至今仍未有商品化疫苗用于其防控。一直以来，对于ASF 疫苗使用的争议从未间断，对其疫苗研发评估/临床应用尤其谨慎。20 世纪60 年代，面对ASF 传入后的快速蔓延，西班牙和葡萄牙曾经进行过弱毒疫苗田间试验，但最终以失败告终，这也是大家对ASF 疫苗抱有“负面期望”的原因之一。为科学分析ASF 疫苗的临床应用风险，笔者搜集整理了20 世纪60 年代的关键文献（以葡萄牙发表的法语文献为主），对该时期葡萄牙的“免疫失败事件”进行详细阐述，以期科学看待ASF 疫苗的使用经验和教训，为未来ASF 疫苗研制提供参考。

1 疫苗田间试验背景

1957 年4 月，ASF 首次从非洲大陆传出，经安哥拉国际航班携带的未熟化的带毒猪肉餐厨垃圾传入葡萄牙里斯本（首发疫情养殖场靠近机场）。随后，葡萄牙共8 个省份471 个地点暴发ASF 疫情，损失16 989 头猪（其中6 352 头发病死亡，其余被扑杀销毁）[1-2]。因采取了快速有效的扑灭措施，如感染畜群的早期发现、隔离、限制移动、扑杀等，葡萄牙第一波疫情于1958 年6 月19 日被全部消灭[3]。1960 年4 月18 日，葡萄牙再次发现ASF 疫情。首发病例发生在第一波疫情曾经出现的里斯本地区，发病原因可能是家猪误食了未合规处理的病猪猪肉制品（有专家认为这次疫情的病原并非来源于境外，但无法确定病毒在这段时间内是如何隐藏的，比较明确的是发病猪群的食物中包含地沟油和餐馆垃圾[2]）。但经部分序列比对分析认为Lisbon60毒株（1960 年传入）和Lisbon57 毒株（1957 年传入）可能为不同来源毒株，两个毒株之间存在一定的抗原差异，如Lisbon57 毒株属于血清1 群，而Lisbon60 毒株属于血清4 群[4]。虽然葡萄牙立刻采取了严格的控制措施，对该农场的所有动物（发病和健康）都进行了扑杀和销毁，但可能由于被污染的肉类在首发病例被发现前就已进入了流通环节，导致ASF 还是传播到了同一地区的其他农场。截至1960 年12 月，葡萄牙共16 个省份187 个地点暴发ASF 疫情，损失14 629 头猪（725 头病死、13 904 头被扑杀，表1）。同年，ASF 经边境传入西班牙（首次疫情发生在靠近葡萄牙边境地区）[5]。

表1 1960 年葡萄牙ASF 疫情发病情况

葡萄牙此轮ASF疫情从1960年开始持续发展，1962 年4 月开始快速蔓延，多地出现持续传播，疫情进一步恶化。因担心疫情失控及对养猪业发达地区产生影响，1962 年5 月葡萄牙启动ASF 疫苗田间试验[6]。

2 弱毒疫苗株背景

20 世纪60 年代葡萄牙使用的疫苗株为细胞传代致弱株。因年代久远，现有资料已无法准确找到该疫苗株详细信息。目前普遍认为，该疫苗株为葡萄牙1960 年分离的里斯本60 毒株（Lisbon 60）或1961 年分离的1455 株（Portuguese isolate 1455）[6]在骨髓细胞连续传代所得。Lisbon60 致弱株接种猪后会使其出现体温反应，但用接种猪抗凝血再次接种试验猪后，被接种猪无体温升高和临床反应，且能在第71 天时抵御口腔强毒感染[7]。另有试验[8]证实，该致弱株以每头105TCID50/mL 剂量接种22头猪后，所有接种猪均健康存活，但在第117 天攻毒后，大部分猪只（17/18）出现体温反应且4 头死亡。

1455株在骨髓细胞连续传代后毒力逐渐下降。40 代和60 代毒可导致接种猪群非特异性运动障碍和典型的ASF 症状，而60 代毒引起的临床症状明显减轻，70 代毒已几乎无法引起运动障碍并能抵御强毒株攻击。为找到最佳传代代次，对该致弱株的第77 代至第84 代进行了大量评估（最终在第80 代通过评价），试验动物数量超过400 头，每月至少对3 头动物进行一次攻毒评价。试验的10个月内，在3～12 月龄的动物中均未观察到明显的临床反应，没有死亡发生。疫苗接种后，有研究[6]发现，运动系统中有不良反应的个体仅占很小的比例，主要是短暂的体温升高和轻微的运动障碍，而且更容易在体重较重的动物身上观察到，当然有时也有一些个体表现出非常严重的体温升高。同时，在疫苗接种动物和同群动物中没有看到明显的临床症状，免疫接种动物在免疫后第14 天便可以检测到抗体产生[3]。

3 疫苗使用经过和后果

20 世纪60 年代初的实验室研究证明，葡萄牙1455 株的细胞传代致弱株安全可靠[6]，但在临床应用时却没有复制出实验室结果。葡萄牙自1962年5 月18 日开始疫苗田间试验，至6 月15 日，共对约40 000 头动物进行了第一次田间接种试验。在疫苗接种地区，ASF 疫情先呈现下降趋势但又急剧反弹，这促使葡萄牙进一步扩大试验规模，至7 月份时试验数量达到顶峰。伴随着ASF 疫情加剧，截止到1962 年12 月底，葡萄牙南部地区共有超过55 万头猪接种了弱毒疫苗（表2）。

表2 1962 年葡萄牙ASF 疫苗接种情况 单位：头

疫苗接种后的几个月，葡萄牙感染区域扩大了3～6 倍，免疫动物死亡率达到10%～50%，且病症出现时间大幅延后[9-10]。经初步统计，在55 万多头接种疫苗的猪群中，有3.4%出现了ASF 发病（包括接种后3 周内发病的猪），另有7%出现了可能与疫苗接种有关的疾病，如仔猪呼吸系统疾病、肌肉骨骼疾病、流产、死产或仔猪早期死亡以及泌乳期的泌乳障碍等。这些发病猪发展到晚期时还会出现并发症，如肺炎、皮肤坏死、关节炎、生殖道炎症或妊娠期疾病、动物生长迟缓、食物加工（消化）指数下降和神经系统疾病等。在这些晚期并发症中，肺部疾病是最严重的，在伊比利亚型幼年病例和某些地区的病例中，还出现较严重的皮肤坏死。所有这些疫苗接种后的并发症在伊比利亚种的猪中出现更为严重和频繁，但在纯种和杂交猪中出现频率较低（杜洛克-泽西品种除外，该品种对ASF 疫苗高度敏感）。

因免疫接种数量众多（55 万多头），难以详细记录接种猪反应，葡萄牙对贝雅（de Beja）地区接种的1 247 个畜群（共计128 684 头）进行了较详细记录，总结如下[6]。

3.1 接种后ASF 发生情况

因疫苗接种时正处于ASF 流行期，故理论上认为，疫苗接种后3 周内发病的应属于潜伏期感染猪，不应作为疫苗评价数据（因实验室数据显示疫苗接种不发病）。事实也发现，在1 247 个接种疫苗的畜群中，共有55 个畜群出现了ASF，其中43个畜群在疫苗接种21 d 内发病，12 个畜群在疫苗接种21 d 后发病（8 个畜群来自最近暴发过ASF的农场，另外4 个畜群感染原因可能是与受感染猪群同圈饲养，表3）。由此推断，接种疫苗21 d 后，ASF 的群体发病率为0.96%（12/1 247），个体发病率为1.05%（1 356/128 684）。

表3 疫苗接种后ASF 发病畜群数统计结果

3.2 仔猪及育肥猪接种后并发症情况

在接种疫苗1 个月后，对各月龄的接种猪进行观察。在观察的69 658 头动物中，大约有12.1%（8 441/69 658）出现了呼吸系统、消化系统、肌肉骨骼和皮肤问题，7%～17%的接种猪因上述问题死亡（未断奶仔猪、3～6 月龄、6～12 月龄、12月龄以上猪死亡率分别为16.9%，10.8%，9.3%，7.0%），见表4。

表4 疫苗接种后仔猪及育肥猪并发症发病情况

3.3 母猪接种后并发症情况

试验记录表明某些畜群接种后出现流产情况非常频繁，而未接种畜群则很少出现。流产在妊娠期间的不同时间均可发生，可发生在早期、中期或晚期。这可能取决于给怀孕母猪注射疫苗的时间，以及疫苗本身和农场所固有的条件。在某些情况下，接种疫苗后可能出现死胎或早产仔猪畸形，然而这些情况随下一次妊娠而消失。母畜不孕症也有发生，特别是在接种疫苗后不久就交配的情况下，但这一情况也随下一次交配妊娠而消失。由于以上不确定原因，葡萄牙禁止对所有母猪接种ASF 疫苗。

3.4 并发症实验室检测情况

因疫苗接种后比较容易观察到的并发症是皮肤问题或肺部损伤，故研究者对这两种样本进行了病毒检测，结果未从皮肤样本中分离到ASF 病毒（ASFV）。更多情况下皮肤坏死由脓杆菌引起（脓杆菌在葡萄牙广泛分布），有时也会从皮肤样本中分离到其他细菌，如化脓性杆菌、化脓性链球菌等。但从肺部病变分离出ASFV 的频率相对较高（强毒为主），分离株接种健康易感猪后有可能诱发ASF 发生，说明感染的ASF 具有传染性和致病力。同时，肺部病料中也能分离到多种细菌，如多杀性巴氏杆菌、化脓性链球菌、葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌）、绿脓杆菌、支气管败血性博德杆菌、大肠杆菌和变形杆菌等。

3.5 屠宰场调查情况

为更深入地分析疫苗接种情况，葡萄牙研究团队对1963 年1—3 月免疫接种猪（11 467 头）和未免疫接种猪（1 078 头）屠宰后的肺部情况进行了比较分析，结果发现疫苗接种猪中有2 513 头出现了肺部病变（占21.92%），未疫苗接种猪中有52 头出现肺部病变（占4.82%）。对接种过疫苗的伊比利亚型纯种（9 384头）及杂交猪种（1 794头）进行更细致的比对，结果发现杂交猪种与伊比利亚品种猪相比，前叶肺炎的发病率高，而其他类型肺炎的发病率低，且不同类型肺炎在两组动物中的差异较大（表5）。

表5 接种疫苗后伊比利亚型纯种及杂交猪肺部炎症发生比例 %

3.6 二免接种情况

疫苗首次接种7 个月后部分猪群又出现了ASF 病例。同时，为评估疫苗二次接种对无明显临床症状猪的影响，葡萄牙对1962 年6—9 月和1963 年1—3 月期间接种的猪群（73 个）进行了二次疫苗接种。结果显示：首次接种无临床症状的19 个畜群（1 210 头）重新接种疫苗后，16 个畜群（1 151 头）没有出现并发症，1 个畜群（20 头）出现ASF，2 个畜群（6 头和33 头）出现死亡病例。首次接种有严重肺炎并发症的54 个畜群重新接种疫苗后，结果9 个畜群出现ASF，6 个畜群出现呼吸系统疾病，剩余的39 个畜群（3 611 头）中3 417 头猪恢复健康，但部分猪在1963 年4 月后又出现明显的并发症。

4 弱毒疫苗使用结果评判

葡萄牙20 世纪60 年代研制的弱毒疫苗经实验室验证，证实接种健康、无寄生虫感染并且营养良好的猪只是安全的，即它不会在接种过该疫苗的猪只或与其接触过的猪只中引起ASF。而且据统计分析，使用该疫苗后的最终损失不超过15%。考虑到疫苗接种时葡萄牙部分地区猪群健康状况较差以及该病快速蔓延的恶性进程，这一死亡率似乎并不高。但因种种原因，葡萄牙不得不终止ASF 疫苗的大范围使用。其原因归根结底仍是该疫苗临床使用时不确定性因素较多，特别是因为葡萄牙疫苗接种是在ASF 疫情大流行中进行的，接种疫苗的动物被饲养在受污染的环境中，以至于（实际）感染病毒的剂量可能超过了“疫苗中和病毒”的能力，这直接导致了部分接种猪在疫苗接种后立刻出现呼吸道症状，且死亡时呈现的肺部病变与现场观察的情况相似。此外，受葡萄牙养殖环境及猪群健康影响，接种猪可能在6 个月或更长时间后开始出现严重的肺部并发症，导致免疫失败。这些现象与同时期实验室攻毒结果相似[11]，后者证实接种ASF 弱毒疫苗后，即使没有强毒株感染，大多数免疫动物仍会发生慢性感染且最终死亡率达到10%～50%。很多病毒携带猪虽能长时间内保持健康状态，但大多数最终发展为慢性肺炎或急性发病死亡。最终的死亡率可能与弱毒株的残存毒力、试验动物的种属差异和接种动物的生存压力等密切相关[12]。

葡萄牙弱毒疫苗毒株扩散演化常与伊比利亚半岛20 世纪60—90 年代的ASF 流行相关联，如1968 年分离的自然弱毒株NH/P68 毒株（又称NHV）经推测可能是葡萄牙疫苗毒演变而来的[13]。此外，同时期伊比利亚半岛可能存在两个强毒株流行（Lisbon57 和Lisbon60），这可能也是部分免疫失败的原因。总而言之，葡萄牙弱毒疫苗使用后的并发症问题超过了实验预期及应急准备，再加上疫苗的超前应用可能使得该事件的发展更加严重，这导致葡萄牙弱毒疫苗的田间大范围应用事件成为“错误的毒株在错误的地区”应用失败的典型案例[3]。

致谢：

葡萄牙里斯本大学的Carlos Martins 研究员为本文提供了相关材料。