一种猪肺炎支原体阳性血清的制备方法

2021-08-06黄玉婷兆丰华生物科技福州有限公司福州350014

福建畜牧兽医 2021年4期

黄玉婷兆丰华生物科技（福州）有限公司福州 350014

猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的猪的一种接触性呼吸系统传染病，在我国也称为猪喘气病。该病发病率高、病死率低，但由于其流行的广泛性、长期性、消耗性，常常降低猪只的平均日增重和饲料转化率，给养猪业带来巨大的经济损失[1]。

目前，疫苗免疫接种是预防和净化猪支原体肺炎最经济有效的手段[2]。根据《兽药质量标准》2017年版生物制品卷规定，猪支原体肺炎活疫苗必须进行鉴别检验，该项检验需用抗Mhp特异性血清（AGP效价≥1:8）对样品进行中和。本研究以兔作为试验动物，建立猪肺炎支原体阳性血清制备方法，不但成本相较于猪低，同时降低了同源动物其它外源病毒的污染风险，为猪肺炎支原体研究、诊断、鉴别等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物体重1.5～3.0 kg新西兰兔，购自上海市松联试验动物场。

1.1.2 猪肺炎支原体（168株）抗原由兆丰华生物科技（福州）有限公司生产，效价为109CCU/mL。

1.1.3 猪支原体肺炎活疫苗（168株）由兆丰华生物科技（福州）有限公司生产，效价为108CCU/头份。

1.1.4 猪鼻支原体（CVCC361）购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 灭活疫苗制备将猪肺炎支原体（168株）抗原用灭活剂进行灭活后乳化，制备猪支原体肺炎灭活疫苗，分装备用。

1.2.2 动物筛选挑选体重1.5～3.0 kg大兔，按照表1中列出的检测方法和判定标准，对猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒等相关抗原抗体进行检测。

1.2.3 动物免疫按表1方法，挑选3只符合要求且生长状况接近的健康雄性大兔，按表2方法进行免疫接种，当达到效价后收获血清。

表1 动物筛选检测项目

表2 猪肺炎支原体阳性血清免疫程序

1.2.4 血清的采集与分离四免后每周采集兔血清并监测抗体水平，当抗体水平达到要求时，用无菌心脏采血法收获并分离血清。

1.2.5 分装保存将混合均匀的血清进行无菌分装，并放置于-20℃以下保存。

1.2.6 琼脂扩散试验称取一定量琼脂粉，按1%比例加入8%生理盐水热溶，将融化的琼脂倒入直径9 cm平板，每块平板25 mL左右，待琼脂冷却后用直径3 mm梅花形打孔器打孔，酒精灯封底。吸取2倍稀释的肺炎支原体抗原至中间孔，所制备的阳性血清按2倍系列稀释加样。加样后，将琼脂平板倒置放入湿盒，于37℃培养24 h后观察结果。

1.2.7 物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验按《中国兽药典》方法进行检测[3]。

1.2.8 猪常见病原检测按表1方法对猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒等相关抗原抗体进行检测。并将猪鼻支原体抗原与所制备的阳性血清进行琼脂扩散试验，观察抗原孔与阳性血清孔之间是否有沉淀产生。

1.2.9 细菌内毒素测定按《中国兽药典》方法进行检测[4]。

1.2.10 鉴别检验将猪支原体肺炎活疫苗（168株）做10倍系列稀释至10-4CCU/mL，与等量所制备的阳性血清混合，在37℃水浴中和2 h，取0.2 mL接种至1.8 mL液体KM2培养基，培养、观察15 d。同时设猪肺炎支原体阴性血清中和对照组、培养基对照组、病毒对照组，观察培养基变色情况。

1.2.11 重复性试验公司不同试验人员做对比试验，按本试验方法挑选3只符合要求且生长状况接近的健康雄性大兔，由3名试验人员做一次重复试验，并在四免后21 d采血收获，测定琼扩效价。