层次分析法及多指标正交试验优化归芪通脉合剂水提工艺△

郭丽，陈皓，贾明璐，于晓涛，李森森，王瑞

漯河市第一人民医院 药学部/河南省工程研究中心，河南 漯河 462005

缺血性脑卒中是在多种因素共同作用下导致的脑动脉血流中断，造成局部脑组织缺氧甚至坏死，具有高发病率、高致残率及高病死率等特征[1-2]。其病因复杂[3]，即使在获得有效治疗后，大部分患者会留下不同程度的后遗症，严重降低患者的生活质量[4]。恢复期是缺血性脑卒中治疗的关键时期[5]。中医认为率中的病机在于脉络痹阻[6]，气虚血瘀是中风恢复期的常见病型[7]。

经典名方“补阳还五汤”能显著改善患者神经功能和血流状态[8-9]。归芪通脉合剂是补阳还五汤的加减方，由黄芪、赤芍、当归、红花、陈皮等14味中药组成，具有补气活血、化瘀通脉的功效，是根据漯河市中心医院临床经验方研制而成的新制剂，用于治疗缺血性脑卒中恢复期的言语謇涩、肢体麻木等。以黄芪为君药，补益元气以行血，瘀去而血通，辅以当归活血养血，赤芍化瘀止痛，全方配伍重用活血行气药配合通经活络之品，补则不滞，温则不燥。根据各药所含成分的理化性质并结合中医临床用药的特点，采用层次分析(analytic hierarchy process，AHP)结合正交试验对提取工艺进行优化，为归芪通脉合剂的深入研究及生产提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC 20AD型HPLC仪[包括二元泵、可制冷自动进样器、二极管阵列检测器(PDA)、柱温箱、色谱工作站]、AUW-120D型十万分之一电子天平(日本Shimadzu公司)；1260型HPLC仪(包括四元泵、紫外检测器、柱温箱、自动进样器、色谱工作站，美国Agilent公司)；5810R型高速离心机(美国Eppendorf公司)；智能恒温数显电加热套(天津泰斯特科技有限公司)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣科技有限公司)；SB25-12D型超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)；Milli-Q型超纯水机(美国Millipore公司)。

1.2 试药

对照品黄芪甲苷(批号：MUST-19091308，纯度：99.89%)、羟基红花黄色素A(HSYA，批号：MUST-19091308，纯度：98.11%)购自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈为色谱纯；甲醇等均为分析纯；水为纯化水。

黄芪饮片(岷县归芪堂药业股份有限公司，批号：20181001)；当归饮片(安徽弘腾药业股份有限公司，批号：181101)；红花饮片(安徽敬道生物科技有限公司，批号：190902)；赤芍饮片(批号：191101)、白僵蚕饮片(批号：191101)、陈皮饮片(批号：181001)均来自安徽药知源中药饮片有限公司。各饮片经漯河市中心医院药品制剂科于晓涛副主任中药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 挥发油的提取

以挥发油提取率为评价指标，采用单因素法考察吸水率、浸泡时间、提取时间[10]和料液比[11]对挥发油提取的影响。

2.1.1吸水率的测定 按处方比例称取当归、川芎、陈皮和白术4味中药共45 g，加入10倍量的水浸没，称质量，室温浸泡90 min，每隔15 min滤过，称质量，并记录浸泡至透心的时间，计算各时间点中药的吸水率，结果见表1。在75 min以后的吸水率无变化，说明其吸水已经达到饱和，吸水率为158.35%。因浸泡60 min吸水率达到149.52%，较45 min增长率为12.07%；浸泡75 min吸水率达到158.35%，较60 min增长率为5.91%，从实际生产效率出发，最终选择浸泡时间为60 min。

表1 归芪通脉合剂中药不同浸泡时间的吸水率

2.1.2提取时间考察 按处方比例称取当归等含油中药2份，每份45 g，加入10倍量水，编号1为未浸泡组，直接提取挥发油，编号2为浸泡组，浸泡60 min后提取挥发油，考察不同提取时间挥发油的提取率，每隔1 h记录挥发油的累计提取量，计算挥发油提取率，结果见表2。浸泡组较未浸泡组挥发油提取率稍高，最终选择采取浸泡60 min后进行挥发油的提取。

(1)

表2 归芪通脉合剂不同提取时间的挥发油提取率 %

2.1.3料液比的考察 按处方比例称取当归等含油中药4份，每份45 g，结合吸水率，按照6、8、10、12倍的料液比，依次加入7.58、9.58、11.58、13.58倍水，浸泡60 min，提取5 h，记录挥发油的累计提取量，计算挥发油提取率，结果见表3。加水为8倍(实加9.58倍)时挥发油提取率最高，综合吸水率和生产加水量的因素，最终确定最佳料液比为1∶10。

表3 归芪通脉合剂不同料液比的挥发油提取率

2.1.4挥发油提取工艺验证实验 按处方比例称取当归等含油中药3份，每份45 g，分别加入10倍量水，浸泡1 h，蒸馏提取5 h，测定挥发油提取量并计算其提取率。结果表明，挥发油的平均提取率为0.89%，RSD为0.65%，与单因素试验结果相近，表明优选的工艺稳定可行。

2.2 正交试验设计

当归等含油中药进行挥发油提取后，收集的蒸馏水另器保存，滤过，水提液存留，滤渣与黄芪、党参、桃仁、红花等其余10味中药共水提取，经单因素预实验，选择提取时间、提取次数、料液比为考察因素，按照L9(34)进行提取(表4)，加入相应倍量的水，浸泡60 min后，回流提取一定时间后，滤过，合并滤液，65 ℃减压浓缩并定容至200 mL，备用。

表4 归芪通脉合剂水提因素水平

选取黄芪甲苷含量、HSYA和干膏得率的综合评分为指标，优选最适宜的共水提取的工艺条件[12]。

2.3 干膏得率的测定

精密吸取各样品浓缩液3份，每份25 mL，置于质量恒定的蒸发皿中，按照浸出物测定法(《中华人民共和国药典》2020年版四部中药浸出物测定法)测定，精密称定干膏质量，并计算干膏得率，求出RSD。

(2)

式中，W为干膏质量；V为浓缩液体积；M为中药干质量。

2.4 指标成分黄芪甲苷的含量测定

2.4.1对照品溶液的制备 精密称定黄芪甲苷对照品10.01 mg于5 mL量瓶中，加甲醇制成对照品储备液，质量浓度为2.00 mg·mL-1。吸取250 μL黄芪甲苷对照品储备液和750 μL甲醇，配成质量浓度为0.50 mg·mL-1的对照品溶液。

2.4.2供试品溶液的制备 分别精密吸取2.2项下由正交设计得到的9种样品的浓缩液5 mL，用水饱和的正丁醇振摇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，加氨液15 mL，静置2 h，弃去氨液，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，4000 r·min-1(离心半径为18.7 cm)离心10 min，取上清液，得到9种供试品溶液。

2.4.3阴性对照溶液的制备 按处方比例称取当归等含油中药，挥发油提取后，蒸馏水另器保存，水提液存留，滤渣与除黄芪外的9味中药共水提取，加入10倍量水，提取2次，每次1 h，减压浓缩至200 mL。按2.4.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.4.4色谱条件 Agilent Zobax SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，雾化载气流速为1.59 L·min-1；以乙腈-水(32∶68)为流动相进行等度洗脱[13]，流速为1.0 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样量为5 μL。

2.4.5线性关系的考察 分别精密吸取对照品溶液2、5、8、12、16 μL，进样测定，以外标两点法对数计算，以黄芪甲苷峰面积的对数值为纵坐标(Y)，以进样量的对数值为横坐标(X)，进行线性回归，得到线性方程：Y=1.840 8X+2.203，r=0.998 5，表明黄芪甲苷进样量在1.001～8.008 μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.6专属性试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液、供试品溶液(编号4)、缺黄芪的阴性对照溶液各5 μL，在2.4.4项下色谱条件下分别进样，记录色谱图，见图1。结果显示，阴性对照品图谱与对照品、供试品图谱中黄芪甲苷相应的保留时间无其他峰干扰，表明阴性无干扰。

注：A.对照品；B.供试品(编号4)；C.阴性对照；1.黄芪甲苷。图1 黄芪甲苷对照品、供试品和阴性对照品色谱图

2.4.7精密度试验 精密吸取同一黄芪甲苷对照品溶液，在2.4.4项下色谱条件下连续进样6次，测定峰面积，峰面积的RSD为0.63%。

2.4.8重复性试验 取同一批样品(编号4)6份，按2.4.2项下方法制备供试品溶液，分别进样测定含量。结果黄芪甲苷平均质量分数为0.08%，RSD为1.39%。

2.4.9加样回收率试验 精密量取已知黄芪甲苷含量的样品溶液(编号4)9份，每3份为一水平，分别精密加入黄芪甲苷对照品0.550 6、1.101 1、1.651 7 mg，按2.4.2项下方法制成供试品溶液，分别进样测定，得平均回收率为98.94%，RSD为2.81%(表5)。

表5 黄芪甲苷的加样回收率结果

2.5 指标成分HSYA的含量测定

2.5.1对照品溶液的制备 精密称定HSYA对照品2.00 mg于2 mL量瓶中，加甲醇制成对照品储备液，质量浓度为1.00 mg·mL-1，吸取甲醇适量，稀释对照品储备液，依次配成981.10、245.30、61.32、15.33、12.26 μg·mL-1的对照品溶液。

2.5.2供试品溶液的制备 分别精密量取2.2项下得到的9种浓缩液1 mL，置于5 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，12 000 r·min-1(离心半径为9.5 cm)离心10 min，取上清液即得9种供试品溶液，置于4 ℃冰箱避光密封保存，备用。

中国无机盐工业协会钾盐钾肥分会会长、青海盐湖工业股份有限公司党委书记、董事长王兴富表示，中国钾肥产业在创新氛围中实现了快速发展。他说：“近年来，在国家发改委、科技部、自然资源部以及青海省直各部门等多个专项项目支持下，通过原始创新、集成创新与引进消化吸收在创新并举，自助探索与产学研相结合，盐湖股份公司实现了多项先进技术的产业化，形成了第三代氯化钾工业技术。察尔汗钾资源总利用率由初期的不足30%提高至70%以上，加工厂综合回收率由60%提升至90%，产品品位KCl含量由不足90%提高到98%。察尔汗盐湖钾盐开发由年产100万吨服务38年增加至年产500万吨服务47年，保障盐湖钾肥可持续发展。”

2.5.3阴性对照品溶液的制备 按处方比例量称取当归等含油中药，挥发油提取后，蒸馏水另器保存，水提液存留，滤渣与除红花外的9味中药共水提取，加入10倍量的水，提取2次，每次1 h，减压浓缩至200 mL。按照2.5.2项下方法制备阴性对照品溶液。

2.5.4色谱条件 采用Gemini Phenomenex-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，采用PDA进行全波长(190～800 nm)扫描，在403 nm波长下响应值最高，故确定HSYA最佳波长为403 nm。以0.1%磷酸水为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱(0～5 min，15%～20%B；5～10 min，20%～22%B；10～20 min，22%B；20～40 min，22%～80%B；40～45 min，80%B)[14]。流速为0.8 mL·min-1；柱温为25 ℃；进样量为5 μL。

2.5.5线性关系考察 以HSYA峰面积值为纵坐标(Y)，以质量浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得到线性方程：Y=14 319X+120 442，r=0.999 8，表明HSYA在12.26～1000.00 μg·mL-1呈良好的线性关系。

2.5.6专属性试验 精密吸取HSYA对照品溶液、供试品溶液、缺红花的阴性对照溶液各5 μL，在2.5.4项下色谱条件下分别进样，记录色谱图，见图2。结果显示，阴性对照品图谱与对照品、供试品图谱中HSYA相应的保留时间无其他峰干扰，表明阴性无干扰。

注：A.对照品；B.供试品(编号4)；C.空白溶剂对照；1.HSYA。图2 HSYA对照品、供试品和阴性对照色谱图

2.5.7精密度试验 精密吸取同一样品(编号4)制备的供试品溶液，在2.5.4项下色谱条件下连续进样6次，测定峰面积，峰面积的RSD为0.46%。

2.5.8重复性试验 取同一样品(编号4)，按2.5.2项下方法制备6份供试品溶液，分别进样测定含量。结果HSYA平均质量分数为1.18%，RSD为1.90%。

表6 HSYA的加样回收率结果

2.6 层次分析法确定权重

根据复方中药味君、臣、佐、使配伍规律，本实验将干膏得率和指标性成分含量作为权重指标予以量化，建立指标的顺序为黄芪甲苷含量>HSYA含量>干膏得率，采用1～9标度法对3项指标进行两两比较，评判重要性[15-16]，见表7。使用一致矩阵法构建优先矩阵，见表8。黄芪甲苷含量相对于干膏得率明显重要，相对权重记为5分；黄芪甲苷含量相对于HSYA含量稍重要，相对权重记为3分。HSYA含量的重要性介于黄芪甲苷含量和干膏得率之间，故相对权重记为2分；反向成对比较时，按其对应的倒数。

表7 归芪通脉合剂目标树各层次评分标准

表8 归芪通脉合剂指标成分对比判断优先矩阵

(3)

2.6.2归一化权重系数(wi) 根据公式(4)计算归一化权重系数(wi)。

(4)

2.6.3一致性检验 根据矩阵最大特征根公式(5)～(6)，计算随机一致性比率。

(5)

(6)

(7)

式中，m为受检验层次的次目标数，CI为一致性检验因子，RI为平均随机一致性指标，CR为矩阵最大特征根，表示一致性比例因子。

经计算，CR=0.003<0.1，表明此3项指标优先比较矩阵满足一致性要求，计算的权重系数合理有效[17]。因此，黄芪甲苷含量、HSYA质量分数和干膏得率的权重系数分别定为0.648 3、0.229 7、0.122 0。

2.7 正交试验结果及方差分析结果

结果见表9～10。

表9 归芪通脉合剂水提工艺正交试验结果

表10 归芪通脉合剂水提工艺方差分析结果

极差分析结果表明，各因素对归芪通脉合剂的水提取实验结果影响大小依次为A>C>B。方差分析结果表明，因素A对综合评分影响差异有统计学意义(影响顺序为A3>A2>A1)，因素C、因素B对综合评分影响差异无统计学意义。因此，水提最佳条件为A2B1C3，同时结合生产的能耗，综合考虑最佳的工艺条件为A2B1C2：当归、川芎等含油中药加入10倍量的水，浸泡60 min，提取5 h，收集蒸馏液，滤过，水提液保留。滤渣与其余10味药材共水提取(红花后下)，加热回流提取2次，每次提取1 h，首次加入12倍量的水，第二次加入10倍量的水，趁热滤过，滤液与上述水提液、蒸馏液合并，弃滤渣。对滤液采用65 ℃减压浓缩，相对密度约为1.06，定容至体积为200 mL。

2.8 验证实验

按处方比例量称取当归、川芎等含油中药45 g，按照筛选得到的最佳提取工艺进行3次验证，分别测定浓缩液的黄芪甲苷含量、HSYA含量和干膏得率，结果黄芪甲苷质量分数分别为0.180%、0.185%、0.184%，平均值为0.18%，RSD为1.41%；HSYA质量分数分别为1.46%、1.45%、1.50%，平均值为1.47%，RSD为1.96%；干膏得率分别为34.97%、35.48%、35.41%，平均干膏得率为35.29%，RSD为0.78%，综合评分分别为97.39、99.14、99.65，平均值为98.73，RSD为1.20%。与正交试验的最大值结果相接近，表明该优选提取工艺条件合理，稳定可行。

3 讨论

本方中黄芪为君药，黄芪甲苷是其发挥药理活性重要的有效成分，选择其作为含量测定的评价指标，既能反映有效成分的提取情况，又能在一定程度上有效控制药品质量。红花主要活性成分HSYA的含量随着时间的增长而减少，可能是因为HSYA是水溶性成分，红花在水中的吸溶剂率高，使HSYA更快地被提取出来，所以实际煎煮过程中考虑将红花后下[18]。本实验还对黄芪甲苷和HSYA的含量测定分别进行了方法学考察，结果RSD均小于3.0，表明检测方法准确可靠。

本方中当归、川芎为臣药，当归挥发油内酯类对大鼠神经功能缺失、脑血管痉挛等有显著保护作用[19-20]，川芎中生物碱川芎嗪具有抗血小板聚集、改善神经功能损伤等作用[21]。故拟定当归、川芎等含油中药蒸馏提取，药渣与黄芪、赤芍等加水共提。对含油中药进行挥发油的提取后，本方中剩余中药主要有效成分均为水溶性成分，提取工艺采用水提法，所得干膏得率是评价中药中主要成分含量和品质优劣的一项重要指标，亦是制剂质量的依据，干膏得率的稳定是制剂成型的重要保证[22]。

中药复方制剂具有多系统、多靶点综合发挥作用的特点，采用多指标权重分析法对处方工艺进行优化，权重系数的赋予是评价综合评分标准的科学性与合理性的直接体现[23]。根据AHP建立对比判断优先矩阵，获取各指标的相对评分。

采用AHP联合正交设计试验优化了归芪通脉合剂的水提工艺，并结合实际产能优化提取工艺，经验证工艺稳定，不仅为归芪通脉合剂的进一步研究奠定了良好的基础，也使得制剂临床应用更加有效。