基于PB-CCD设计的化香树果序碱提酸沉提取工艺△

汪芸兰，张鹏，胡坤霞，韩立柱，邱金清，赵佩媛，张新博，宋逍，唐志书

陕西中医药大学 药学院，陕西 咸阳 712046

化香树果序为胡桃科植物化香树的果序[1]，别名化香树球、化香果等。根据《湖南药物志》记载，其具有活血行气、杀虫止痒、消肿止痛的功效，通常用于治疗鼻炎等相关病症[2]、内伤所致胸腹胀痛、跌打损伤、筋骨疼痛，也可用于治疗痈肿、疥癣、湿疮等[3]。现代药理研究表明，化香树果序具有抗炎抑菌、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[4]。近些年来发现，化香树果序中有效成分鞣花酸具有抗炎、抗氧化[5]、调节肠道菌群[6]等生物活性，且具有明显抗癌、抗诱变活性，尤其是对肝癌[7]、肺癌、鼻咽癌[8]、子宫内膜癌[9]等有很好的抑制作用，因此有非常好的市场应用前景。

本研究以碱提酸沉法提取，考察液料比、提取时间、提取温度、碱提液pH、酸沉液体积分数对化香树果序内鞣花酸提取率的影响[10]，结合响应面法优化化香树果序碱提酸沉提取工艺，得到可靠的提取工艺条件，以期为化香树果序鞣花酸提取开发利用提供参考[11]。

1 材料

1.1 仪器

Ulti Mate 3000型高效液相色谱仪(Thermo Fisher公司)；Vortex-Genie2型旋涡混合器(北京卓信宏业仪器设备有限公司)；800型离心机(上海手术器械10厂)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PHS-25型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；800Y型高速多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)；FA21040N型电子天平(十万分之一，赛多利斯上海贸易有限公司)。

1.2 试药

对照品鞣花酸(中国食品药品检定研究院，批号：111959-201903，纯度：98.8%)；氢氧化钠(分析纯，天津北联精细化学品开发有限公司)；盐酸(分析纯，江苏彤晟化学试剂有限公司)；色谱乙腈、色谱甲醇(Fisher公司)；无水乙醇(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)。

化香树果序(香菊制药有限责任公司，批号：20190712)经陕西中医药大学胡本祥教授鉴定为胡桃科化香树属植物化香树PlatycaryastrobilaceaSieb.et Zucc的干燥果实。

2 方法

2.1 HPLC条件

色谱柱：AcclaimTM120A C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，等度洗脱(20∶80)；柱温：30 ℃；流速：1 mL·min-1；检测波长：254 nm[12]；进样量：10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取化香树果序粗粉约5.0 g，置于100 mL锥形瓶中，按PB试验设计的方案加入一定量的一定pH的氢氧化钠溶液，于一定温度，提取一定时间，滤过，提取一定次数后合并滤液，以一定体积分数的盐酸溶液滴定至pH为1，静置24 h，抽滤，弃滤液，滤饼层于室温条件下自然干燥，称质量，备用。精密称取滤饼层样品0.1 g，置于10 mL的量瓶中，65%乙醇溶解并稀释至刻度，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

取鞣花酸对照品，精密称取2.0 mg，配以色谱纯甲醇70 mL移至100 mL量瓶，超声5 min，取出，待恢复至室温后，加甲醇稀释至100 mL，摇匀后得质量浓度为0.191 1 mg·mL-1的鞣花酸对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1专属性考察 精密量取鞣花酸对照品溶液、65%乙醇、供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。见图1。

注：A.鞣花酸对照品；B.供试品溶液。图1 鞣花酸及化香树果序供试品HPLC图

2.4.2线性关系考察 精密称取鞣花酸对照品2.10 mg，然后配以色谱甲醇4 mL，超声10 min，振摇15 min，标记为1，取1中鞣花酸对照品溶液1 mL，精密移取至已经精密吸取色谱甲醇1 mL的2 mL离心管中，超声10 min，振摇15 min，标记为2，重复操作5次。将5次所得溶液过微孔滤膜后进行进样分析，测定峰面积。以进样质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。

2.4.3精密度考察 精密吸取同一对照品溶液10 μL，连续进样6次。

2.4.4稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液10 μL，在室温下放置0、2、4、8、12、24 h时进样，记录色谱图。

2.4.5重复性考察 精密称取同一样品，重复操作6次，依法加色谱甲醇制备供试品溶液，测定含量。

2.4.6加样回收率试验 取鞣花酸质量浓度为1.29 mg·mL-1的样品，重复3次。每份为0.1 mL，每份分别精密加入质量浓度为0.198 mg·mL-1的鞣花酸对照品溶液0.31、0.62、0.93 mL，制得高、中、低质量浓度的溶液共9份，按2.1项下色谱条件进行测定。记录峰面积，计算加样回收率及RSD。

2.5 Plackett-Burman(PB)试验设计

根据提取过程中的影响因素，选择液料比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、碱提液pH(D)、酸沉液体积分数(E)，每个因素设定最低限度和最高限度[13]。PB设计因素与水平见表1。按照PB设计，5个因素进行12次试验，进行化香树果序提取，采用高效液相色谱法(HPLC)检测化香树果序中鞣花酸含量，以鞣花酸峰面积作为响应因子，根据PB试验结果确定对提取过程影响较大的3个因素。

表1 化香树果序碱提酸沉提取PB设计因素与水平

3 结果与分析

3.1 方法学考察结果

专属性考察结果展示的色谱峰分离度良好，峰形尖锐，符合含量测定要求(图1)；线性关系考察得到鞣花酸的回归方程：Y=1 146.5X-11.57(r=0.999 4)，结果表明，鞣花酸在0.032 16～0.514 50 mg·mL-1与其峰面积线性关系良好；精密度考察结果鞣花酸峰面积RSD为1.32%，说明此仪器精密度良好；稳定性考察结果显示，24 h内RSD为1.16%，表明此溶液在室温下放置24 h内稳定；重复性考察所得鞣花酸平均质量分数为0.79 mg·g-1，RSD为0.98%，表明此方法重复性良好；加样回收结果得鞣花酸平均回收率为99.79%，RSD为0.48%(表2)。

表2 化香树果序碱提酸沉提取鞣花酸加样回收率考察结果

3.2 PB试验

根据PB试验方案进行试验，结果见表3。

表3 化香树果序碱提酸沉提取PB试验设计及结果

采用Design-Expert Version 10.0.7统计软件进行ANOVA方差分析，由分析结果(表4)可知，液料比、提取温度、碱提液pH的P值分别为0.022 7、0.047 6、0.015 0，均小于0.05，说明液料比、提取温度、碱提液pH是影响化香树果序碱提酸沉法提取鞣花酸的显著因素。根据各影响因素对鞣花酸峰面积的ANOVA分析，结合最大值运算结果，将影响不显著的因子进行最大值预测，结果提取时间为81.631 2 min，酸沉液体积分数为9.614 09%，结合实际情况选择提取时间为80 min，酸沉液体积分数为10%。

表4 化香树果序碱提酸沉提取PB试验设计数据ANOVA方差分析

3.3 星点设计(CCD)试验

在PB结果的基础上，以CCD对响应因子具有显著性影响的因素A、C、D进行优化，以确定最优的参数设置，通过HPLC测定鞣花酸含量。

采用Design-Expert Version 10.0.7软件设计优化试验，CCD影响因素水平设计见表5，CCD试验设计及结果见表6。根据结果，绘制此次实验数据的效应曲面图和等高线图(图2～4)。在3种因素交互作用的三维图中，碱提液pH与提取温度的响应面的曲张程度最大，而液料比与提取温度、液料比与碱提液pH的响应面的曲线较平滑，表明碱提液pH与提取温度间的交互作用强于其他因素间的交互作用[14]。

表5 化香树果序碱提酸沉提取CCD试验影响因素与水平

表6 化香树果序碱提酸沉提取CCD三因素五水平试验及结果

图2 提取温度与液料比对化香树果序中鞣花酸含量的交互影响

图3 碱提液pH与液料比对化香树果序中鞣花酸含量的交互影响

图4 提取温度与碱提液pH对化香树果序中鞣花酸含量的交互影响

3.4 回归模型建立与验证分析

使用Design-Expert Version 10.0.7统计软件对表6的试验结果进行拟合分析，得到自变量A、C、D与因变量鞣花酸含量的二次多项回归方程为Y=0.52+0.052A+0.13C+0.41D+0.067AC-0.008AD-0.042CD-0.22A2+0.18C2+0.29D2。方差分析结果见表7。

表7 化香树果序碱提酸沉提取CCD三因素五水平试验设计结果数据ANOVA方差分析

由表7可知，回归模型极为显著(P<0.01)，模型的决定系数R2=0.913 1，说明回归模型中自变量与因变量的回归关系是显著的，具有统计学意义[15]。失拟项P值为0.221 5>0.05，失拟项不显著，表明此回归方程拟合程度良好。各因素对碱提酸沉法提取鞣花酸的影响顺序为D>C>A。

3.5 最优工艺与验证实验

根据PB-CCD设计结果，液料比13.016 7、提取温度85 ℃、碱提液pH 13，结合实际生产情况，将最优工艺参数调整为提取时间80 min、酸沉液体积分数10%、液料比13、提取温度85 ℃、碱提液pH 13。在此条件下，重复进行3次提取试验，鞣花酸质量分数分别为1.47、1.46、1.47 mg·g-1，平均质量分数为1.47 mg·g-1，与理论值1.45 mg·g-1相近，说明本实验最终得到的碱提酸沉法提取化香树果序中鞣花酸的提取工艺稳定可靠。

4 讨论与结论

响应面分析法是一种比较有效的数学统计方法，采用多元二次回归方程来拟合各个影响因素与相应响应值之间的函数关系，寻找最优的工艺参数。相比于单因素试验和正交试验设计，试验次数少、周期短、模型预测性良好。本实验采用PB-CCD设计，以鞣花酸含量为考察指标，优化化香树果序碱提酸沉提取工艺。通过PB设计选定5个影响因素：液料比、提取时间、提取温度、碱提液pH、酸沉液体积分数进行试验。预实验过程中发现，当碱提液pH为8～14时，体积分数为8%和14%的酸沉液均无法在滴定pH>1获得碱提酸沉提取物，因此，选择酸沉pH终点为1。再筛选出的3个显著影响因素：液料比、提取温度、碱提液pH继续进行优化，确定鞣花酸提取的最佳工艺：液料比13、提取时间80 min、提取温度85 ℃、碱提液pH 13、酸沉液体积分数10%。实验结果为下一步开发利用化香树果序及其鞣花酸打下了良好基础，后期可对化香树果序碱提酸沉液中的有效成分进行研究。