高原对雄性大鼠生殖系统的影响及其机制研究*

常德辉 周 昕,2 孔飞燕,2 丁豪帅,2，王 玲

1.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院泌尿外科（甘肃兰州 730050）；2.甘肃中医药大学临床医学院（甘肃兰州 730000）；3.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院生殖医学中心（甘肃兰州 730050）

高原地区恶劣的气候环境会对机体的多个系统造成影响，甚至出现病理损伤，其中低氧是造成机体损伤的主要因素。研究表明高原低氧环境可造成雄性精子质量的降低和性激素的紊乱，从而影响雄性的生育能力[1]。造成上述损伤的基础是低氧导致机体处于氧化应激状态并引起生殖细胞的凋亡[2]。为了减轻高原环境对生殖系统造成的损伤，机体会发生一系列的应答反应。既往的研究多集中在高原环境对雄性生殖系统造成的损伤，而对于机体的保护应答机制研究较少。

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）在男性生殖发育和维持睾丸内稳态中发挥着重要作用，激活该通路可促进生殖细胞的增殖[3]。本研究通过建立高原雄性大鼠氧化应激损伤模型，研究PI3K/AKT信号通路在高原环境下对雄性大鼠生殖系统氧化应激损伤发挥的作用，为今后高原环境下雄性生殖系统的防护研究奠定基础。

材料与方法

一、实验动物与分组

8周龄SPF级Wistar雄性大鼠30只，许可证号：SCXK（京）2019-0010，购自北京斯贝福生物技术有限公司，体重180~200g。将大鼠随机分为平原组和高原组，每组15只。平原组饲养于我院动物中心，环境温度25℃左右，12h昼夜交替。高原组饲养于我院低压低氧动物实验舱内，设置模拟海拔高度为6000m,舱内温度控制在25℃左右，12h明暗环境交替，共饲养14d。

二、实验药物和试剂

左卡尼汀注射液（东北制药有限公司）；精子形态、精子活体染色液（上海索莱宝公司）；血清睾酮T、促卵泡刺激素FSH、促黄体生成素LH试剂盒（上海丰翔生物有限公司）；丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒（南京建成科技有限公司）；PI3K、AKT抗体（北京博奥森生物，批号：bs-0128R、bs-6951R）；RIPA裂解液（北京索莱宝公司，批号：R0010）；BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝公司，批号：PC0020）；HifairⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR HifairTM qPCR和Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（上海翊生生物，批号：H3001010和H8001160）。

三、实验主要仪器

模拟高原环境动物实验舱（中航工业贵州风雷航空机械有限责任公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；实时定量PCR仪（美国Thermo，型号：StepOne Plus）；酶标仪（美国Bio Rad，型号：iMark）；化学发光成像仪（北京赛智科技有限公司，型号：MiniChemi610）；37℃恒温箱（上海一恒科技有限公司）。

四、精子参数

分离大鼠双侧附睾尾，清洗干净后放置预热的PBS溶液中剪碎混合20min，过滤后在37℃恒温箱中静置3min取上清。参照《WHO人类精液检查与实验室处理手册》在显微镜下观察精子活动率、精子畸形率、精子计数。

五、性激素水平测定

通过腹主动脉采集血液，将血液收集到促凝管中，室温条件下静置，待血清凝固后离心取上清，按照试剂盒说明测定大鼠血清睾酮（T）、黄体生成素（LH）、促卵泡生成激素（FSH）水平。

六、HE染色观察大鼠睾丸形态

摘除大鼠右侧睾丸组织后清洗干净放置在4%多聚甲醛中固定48h，取出睾丸组织行石蜡包埋，切片，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，分化，氨水反蓝后伊红染色，脱蜡脱水，最后中性树胶封片观察。

七、MDA、SOD、GSH-Px的测定

按试剂盒说明书检测睾丸组织中MDA、SOD、GSH-Px含量。

八、Western blot检测大鼠睾丸组织中PI3K、AKT蛋白的表达

摘除大鼠左侧睾丸组织在液氮中保存，取200mg左右的冷冻标本加入裂解液冰上研磨，研磨充分后离心取上清。蛋白定量试剂盒进行定量。98℃煮沸冰浴使蛋白变性，配制10%分离胶，上样，电泳和转膜。5%脱脂奶粉封闭1.5h，孵育一抗4℃过夜，洗膜后加入二抗，再次清洗后曝光显影。采用Image J对条带量化分析。

九、荧光定量PCR检测大鼠睾丸组织中PI3K、AKTmRNA表达水平

从液氮罐中取出冷冻睾丸组织，提取组织中RNA，配 制RNA去DNA反 应 体 系，42℃孵 育2min，4℃放置。在RNase-Free microtube管中配制cDNA合成反应体系在PCR扩增仪上进行反应，PI3K、AKT、GAPDH引物序列见表1，配制PCR反应体系。随后预变性、变性、退火和延伸。反应结束计算相对表达量2-ΔΔct。

表1 PCR引物序列

十、统计学分析

采用SPSS21.0软件进行数据分析，对符合正态分布的定量资料采用两独立样本t检验的方法。P＜0.05表示有统计学差异。

结 果

一、高原对雄性大鼠模型精子质量的影响

与平原组相比，高原组大鼠精子计数、活动率均显著降低（P＜0.01）；畸形率显著升高（P＜0.01）。

图1 高原对雄性大鼠模型精子质量的影响

二、高原对雄性大鼠模型血清性激素水平的影响

与平原组相比，高原组大鼠血清促卵泡刺激素FSH、睾酮T显著降低（P＜0.01），黄体生成素LH无差异（P＞0.05）。

图2 高原对雄性大鼠模型血清性激素水平的影响

三、HE染色睾丸形态学的变化

平原组大鼠睾丸组织形态未见明显异常。高原组大鼠的睾丸组织形态可见明显异常，生精小管基膜受损萎缩变薄并可见明显空泡，精子数量减少明显，细胞极性消失，层数减少且排列紊乱。

图3 HE染色睾丸形态学的变化

四、大鼠睾丸组织中氧化应激相关指标表达水平

与平原组相比，高原组大鼠睾丸组织中丙二醛（MDA）水平显著升高（P＜0.05），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px显著降低（P＜0.05）。

图4 大鼠睾丸组织中氧化应激相关指标表达水平

五、Western blot检测大鼠睾丸组织中PI3K、AKT蛋白的表达

与平原组相比，高原组大鼠睾丸组织中PI3K、AKT表达水平显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。

图5 Western blot检测大鼠睾丸组织中PI3K、AKT蛋白的表达

六、荧光定量PCR检测大鼠睾丸组织中PI3K、AKTmRNA表达水平

与平原组相比，高原组大鼠睾丸组织中PI3K、AKTmRNA水平显著升高（P＜0.01）

图6 荧光定量PCR检测大鼠睾丸组织中PI3K、AKTmRNA表达水平

讨 论

高原地区特殊的自然环境包括低氧低压、空气干燥、昼夜温差大、日照时间长及紫外线强，国内外多项研究证实这些因素会对雄性生育能力造成不利影响。评价雄性生育能力的两个重要指标是精子质量和性激素。在本研究中，模拟海拔高度6000m，暴露时间为14d，观察到同平原组比较，高原组雄性大鼠的精子计数和活动率显著降低，畸形率明显升高。

从基础到临床的多项研究都已证实高原环境会导致雄性精子质量下降和性激素紊乱。Gasco[4]等的基础实验证实，将大鼠暴露在4340m的高海拔地区，从第3d起可观察到生精小管周期的改变，在第7d大鼠附睾中的精子质量显著减少，第14d睾丸和附睾的重量会下降。由于本研究采用的模拟低压、低氧舱，高原实地环境和模拟海拔高度存在一定差异，所以模拟的海拔高度较实地研究的海拔高度略高，而最终结果都显示高原暴露会对雄性大鼠精液质量造成明显损伤。He等[5]的临床研究也证实了这一观点。高原环境对精子质量的影响机制可能是以下几部分原因[5,6,7]：（1）机体缺氧导致肾上腺皮质及睾丸间质细胞受损，睾酮分泌下降，间接影响雌二醇的含量，雌二醇水平下降会降低气道的反应性从而加重缺氧；（2）缺氧可直接影响精子质量，使性激素结合球蛋白升高，间接降低游离的睾酮水平从而抑制男性的性腺功能；（3）缺氧状态下机体的血液进行重新分配，优先供给大脑和心脏等重要脏器，导致睾丸处于缺血状态造成生精上皮细胞的受损。

黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）和睾酮（T）都是影响男性生殖健康的主要激素，高原环境对性激素水平影响的研究结果仍存在争议。本研究结果显示在大鼠暴露在模拟高原环境下14d时，血清中FSH、T较平原组显著降低，LH无显著变化。高亮[8]等人研究了高原驻训官兵在高原驻训1个月后与驻训前的性激素变化，结果与本研究结果一致。He[5]等人的研究显示在高海拔暴露6个月时，LH、T水平显著降低，FSH显著升高，在暴露12个月时，FSH降低，LH、T升高。研究结果的差异可能是由于暴露的时间长短导致的。高原导致性激素的紊乱可能原因是机体内大部分T是由睾丸间质细胞分泌的，线粒体参与T的合成，急性和慢性低氧时线粒体类固醇脱氢酶活性降低所致[8]。但暴露的时间与血清性激素变化水平规律还需进一步研究。

通过对大鼠睾丸形态的直接观察，结果显示高原暴露可使大鼠的睾丸组织形态发生异常变化，生精小管基膜受损、萎缩、变薄，并可见明显空泡，精子数量减少明显，细胞极性消失，层数减少且排列紊乱。这与Gasco[4]等的研究一致。造成睾丸形态的改变及精液质量的下降的原因是在低氧状态下睾丸处于氧化应激的状态[2]。高原低氧环境下机体内活性氧（ROS）会产生增加，引起睾丸中的脂质过氧化，脂质过氧化会产生代谢产物丙二醛（MDA）。睾丸中也存在抗氧化物酶来抵御氧化损伤，其中最主要是过氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）[9]。本次研究发现，高原组较平原组的MDA水平明显升高，SOD、GSH-Px水平明显下降，说明高原低氧状态下睾丸处于氧化应激损伤的状态，这与Vats[10]等的研究结果相一致，睾丸处于氧化应激状态会导致生殖细胞的凋亡增加。

PI3K/Akt信号通路可调节细胞的存活、增殖、血管生成、葡萄糖代谢等[11]。在睾丸组织中，PI3K/Akt信号通路可以调节睾丸支持细胞的增值、分化和精子的发生[12]。本研究结果显示跟平原组相比，高原组大鼠睾丸组织中，PI3K、Akt蛋白表达水平及mRNA水平明显升高，说明机体通过激活该通路来减轻高原低氧环境对睾丸造成的损伤。施源[13]等人研究发现血必净可通过激活PI3K/Akt信号通路来减轻睾丸的缺血再灌注损伤。另外，有研究表明某些作用于PI3K/AKT信号通路的药物可以通过抗凋亡和抗氧化损伤等途径来减轻高原低氧对脑组织和心肌组织的损伤[14,15]。

综上所述，高原低氧环境可对雄性大鼠生殖系统造成损伤，包括精子质量下降、血清性激素的紊乱及睾丸病理结构的改变，造成以上改变的原因主要是睾丸处于氧化应激的状态。机体会反应性激活PI3K/Akt信号通路来减轻氧化应激状态下睾丸的损伤。本研究结果提示某些作用于PI3K/Akt信号通路的一些抗氧化药物可能会进一步减轻高原低氧环境下睾丸的损伤，该研究可为今后高原环境下男性生殖功能的防护工作提供理论依据。