嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpK的原核表达、抗原性分析及抗血浆杀菌作用研究

荣 娜，康 超，孙 薇，简思杰，伍娜娜，刘 祥

(陕西理工大学生物科学与工程学院，中德天然产物研究所，陕西 汉中 723001)

【研究意义】嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)为革兰氏阴性短杆菌，是一种条件性病原菌[1]，主要感染淡水鱼类，引发局部出血和败血症[2-3]，给渔业生产造成巨大经济损失。此外，人类的脑膜炎、胃肠炎和败血症等疾病也和此菌有关[4]。嗜水气单胞菌疾病传统上是用抗生素控制，但长期使用会导致机体药物残留和菌株耐药性等问题[5-6]。疫苗接种作为一种有效策略，已经在大规模商业养殖中发挥了重要作用[7]，但目前还未研制出抗嗜水气单胞菌感染的商用疫苗，大多研究主要集中于实验室研发阶段[8-9]。因此，开发嗜水气单胞菌新型渔用疫苗至关重要。【前人研究进展】外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP)是嗜水气单胞菌的毒力因子之一[10]，位于细菌最外层，使得蛋白抗原表位暴露[11]，易被宿主识别为外来物质而激发免疫应答，在嗜水气单胞菌感染的防治中具有重要作用。Khushiramani等[12]用纯化的外膜蛋白OmpTS免疫鲤鱼并制备了滴度较高的抗体，证实该蛋白在鲤鱼体内具有高度的免疫原性。Maiti等[13]利用外膜蛋白OmpW在兔体内制备了抗重组蛋白的多克隆抗体，并证实了抗体的特异性反应。因此，嗜水气单胞菌外膜蛋白有望成为疫苗开发的靶点。【本研究切入点】本研究选取嗜水气单胞菌主要外膜蛋白OmpK为研究对象，对其进行生物信息学分析，分子克隆获得OmpK蛋白的原核表达菌株，探讨其最佳表达条件；纯化获得OmpK蛋白并制备小鼠抗血清；探究OmpK蛋白抵抗鱼血浆杀菌的作用。【拟解决的关键问题】此研究结果为嗜水气单胞菌OmpK蛋白功能研究与疫苗开发提供支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 实验材料 嗜水气单胞菌ATCC 7966、EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21菌株及pET-32a质粒由陕西理工大学中德天然产物研究所保存；昆明鼠购自西安交通大学实验动物中心。

1.1.2 实验试剂Taq聚合酶、内切酶BamH Ι和XhoΙ、T4-DNA连接酶购自TaKaRa公司；细菌基因组提取、质粒提取试剂盒购自上海生工公司；IPTG购自西安沃尔森生物科技有限公司；TMB显色液为西安赫特生物科技有限公司产品；山羊抗小鼠IgG二抗购于Sigma公司；引物合成、基因测序由天润奥科生物公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析 查找并获取不同菌株OmpK的蛋白序列，利用GeneDoc软件和MEGA软件分别进行OmpK同源性比对和系统发育分析；通过ProParam数据库预测OmpK的等电点、亲水性和半衰期等理化性质，并在ProScale analysis数据库中获取亲水性图谱；采用TMHMM 2.0和SignalP 5.0软件预测OmpK的跨膜结构和信号肽区域，并通过SOPMA和SWISS-MODEL软件预测OmpK的二级结构和三级结构。最后使用STRING软件在线构建OmpK与其它蛋白的相互作用关系网络。

1.2.2 重组质粒的构建 根据NCBI数据库公布的嗜水气单胞菌ATCC7966全基因组，设计引物扩增ompK基因。序列如下：Sense Primer: AAAGGAT CCATGGCCAAATTTACCAAGAC; Anti-sense Primer: AGCCTCGAGTTAGAACTTGTAGGTAAC(划线位置分别为酶切位点BamH Ι和XhoⅠ)。以全基因组作为模板，利用Taq聚合酶扩增ompK基因，扩增体系为50 μL，退火温度、延伸时间分别设定为55 ℃、1 min。PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶鉴定后回收，使用BamH Ι 和XhoⅠ2种内切酶双酶切质粒pET-32a与PCR产物，通过T4-DNA连接酶将ompK基因连接至质粒pET-32a，转化E.coliDH5a中，获得重组质粒。双酶切和基因测序进一步鉴定重组质粒，将构建成功的重组质粒转化至E.coliBL21中，进行OmpK蛋白外源表达。

1.2.3 重组蛋白的表达及纯化 挑取表达菌单菌落培养12～16 h，以1∶100转接至新的培养液中培养至OD600为0.6，加入0.1 mol/L的IPTG，摇床诱导6 h，收集1 mL菌液，菌体加入蛋白上样缓冲液后于沸水中煮样5 min，通过SDS-PAGE电泳检测OmpK蛋白表达，结合包涵体洗涤和SDS-PAGE蛋白电泳切胶法纯化OmpK蛋白。

1.2.4 重组蛋白表达条件的优化 采用L9(34)正交实验模型(表1)探究OmpK蛋白最佳表达条件。主要步骤为：将过夜培养的OmpK表达菌液以1∶100比例接入600 mL培养液中，37 ℃、200 r/min培养至设定的OD600值，按照表中要求加入不同浓度的IPTG，每组进行3次重复。取1 mL诱导菌液，菌体加入蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min，样品通过SDS-PAGE电泳获得不同诱导条件下的OmpK蛋白表达图谱。通过软件Phoretix 1D和SPSS分别对表达图谱光密度和不同因子作以显著性分析。

1.2.5 蛋白小鼠抗血清的制备及特异性检测 选用20 g左右昆明鼠，实验前饲养3 d，实验组和对照组各10只。取100 μg纯化的OmpK蛋白与100 μL弗氏完全佐剂充分混合，腹腔注射免疫小鼠。14 d后，等量蛋白混合100 μL弗氏不完全佐剂，加强免疫小鼠。7 d后，进行第3次免疫，对照组免疫PBS。

1周后眼球取血，血液于4 ℃待血清自然析出后，3000 r/min离心10 min，收集抗血清于-80 ℃备用。

采用Western blot检测OmpK抗血清的特异性，简要过程如下：SDS-PAGE电泳嗜水气单胞菌全蛋白，于80 V电压下转NC膜，NC膜在含5%脱脂牛奶的TNT缓冲液中充分封闭2 h后，与不同稀释倍数(1∶400, 1∶800, 1∶1200, 1∶1600)的OmpK小鼠抗血清于室温孵育90 min，对照为阴性抗血清。NC膜经洗涤后与二抗(1∶3000倍稀释)于室温孵育90 min，在DAB显色液中充分显色以检测OmpK抗血清的特异性。

1.2.6 体外模拟蛋白抗血清与嗜水气单胞菌的相互作用 采用酶联免疫法检测OmpK抗血清与嗜水气单胞菌的体外相互作用：培养嗜水气单胞菌至OD600约1.0，菌体用1%的甲醛生理盐水80 ℃灭活90 min，生理盐水调整菌液OD600为0.2，分装为1 mL/管(菌量108cfu)。取100 μL不同稀释倍数的OmpK抗血清(1∶400, 1∶800, 1∶1600, 1∶3200, 1∶6400)与小管菌体于室温轻摇孵育90 min，对照为阴性血清。菌体再与200 μL的二抗(1∶3000倍稀释)孵育1 h，用20 μL PBS重悬菌体并转移至酶标板中，加入200 μL TMB显色液，避光充分显色10 min，加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应，450 nm处测定吸光值。

1.2.7 蛋白抵抗血浆杀菌作用 培养嗜水气单胞菌12～16 h，以1∶100比例接入100 mL新的培养液，培养至OD600为0.5，菌体用0.85%生理盐水洗涤并调整OD600为1.0，分装为1 mL/管，小管菌体分别与600 μL不同稀释倍数的鱼血浆(未稀释血浆、1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32)于28 ℃，200 r/min孵育5 h，对照为生理盐水。洗涤菌体3次，SDS-PAGE分离全菌蛋白并转NC膜，NC膜充分封闭后依次与一抗、二抗孵育，采用DAB显色法进行显色，通过观察特异性条带的亮度分析OmpK蛋白的差异表达，评价其抵抗血浆杀菌的作用。

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析

2.1.1 OmpK蛋白的同源性与系统发育分析 利用GeneDoc软件绘制气单胞菌属间不同菌株的OmpK蛋白氨基酸序列同源比对图(图1)，气单胞菌属间不同菌株OmpK蛋白同源性均较高。使用MEGA软件进行系统发育分析(图2)，发现不同种类的气单胞菌间进化关系较近，其中嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和中间气单胞菌3种菌株亲缘关系更为紧密。因此，推测OmpK蛋白可能为不同种类的气单胞菌提供交叉免疫保护作用。

图2 OmpK系统发育树

2.1.2 OmpK理化性质、结构与功能预测 ProtParam数据库分析显示：OmpK含有280个氨基酸，分子量大小为32061.57，等电点为5.08，半衰期大于10 h，不稳定指数为27.40，属于稳定蛋白；亲水性图谱分析显示氨基酸最大分值为0.011，最小为-2.010，亲水性平均值为-0.430，表明OmpK为亲水性蛋白(图3-A)；由跨膜结构预测图谱(图3-B)可知，7～30位氨基酸形成一个可信度较高的跨膜区域；信号肽预测结果(图3-C)显示，该蛋白的信号肽组成序列为1～23位氨基酸，23～24位氨基酸之间存在切割位点，可信度达到0.9444；SOPMA软件二级结构预测显示，α-螺旋占全序列18.57%，延伸链占33.93%，无规则卷曲占47.50%(图3-D)。SWISS-MODEL软件三级结构预测结果显示，OmpK蛋白的的三维结构呈现为桶状(图3-E)；通过STRING数据库构建蛋白互作网络，发现仅有gpt与AHA-1131 2种蛋白与OmpK存在直接作用(图3-F)。

A：亲水性预测；B：跨膜结构预测；C：信号肽预测；D：二级结构预测；E：三级结构预测；F：蛋白互作网络

2.2 OmpK重组菌株的构建

以全基因组为模板，利用上下游引物扩增ompK基因，电泳检测显示约在843 bp处有目标条带存在(图4-A)，大小与ompK基因相一致。重组质粒pET-32a-ompK经BamH Ι和XhoⅠ双酶切，得到约843 bp的目标条带，符合理论大小(图4-B)。目的基因经测序比对，显示与NCBI公布的ompK基因序列一致，表明成功构建重组质粒，转化至E.coliBL21获得OmpK重组表达菌株。

A：PCR扩增ompK基因；B：重组质粒的双酶切；M：DNA marker；1：ompK基因；2：重组质粒pET-32a-ompK；3：Bam H Ι和Xho Ⅰ双酶切

2.3 OmpK蛋白的表达纯化

OmpK重组菌株经IPTG诱导表达，电泳显示目标蛋白成功表达，分子量大小约51 kDa；利用包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶法纯化获得OmpK蛋白(图5)。

M：蛋白marker；1：未诱导菌株；2：诱导菌株；3：纯化的OmpK蛋白

2.4 OmpK蛋白最佳表达条件的优化

为确定OmpK蛋白的最佳表达条件，每个条件组合进行3组重复。诱导菌液经SDS-PAGE电泳获得不同诱导条件下的蛋白表达图谱(图6)，从表3可得出，OmpK菌株最佳表达条件组合为A3B3C3D2，即在菌液浓度达到OD600=1.0时，选择终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，于28 ℃诱导8 h。由表4表明，在OmpK蛋白诱导表达时，诱导剂IPTG浓度达到显著性，因此，适度的诱导剂浓度对于OmpK蛋白的高效表达尤为重要。

表2 OmpK蛋白表达图谱光密度分析

表3 OmpK光密度数值的极差分析

表4 OmpK光密度数值的方差分析

A，B，C为3次重复；M：蛋白marker；1：未诱导菌株；2～4：OD600值为0.5，诱导温度分别为28，32，37 ℃：5～7：OD600值为0.8，诱导温度分别为28，32，37 ℃；8～10：OD600值为1.0，诱导温度分别为28，32，37 ℃

2.5 OmpK蛋白抗血清的特异性与效价检测

Western blot验证OmpK蛋白抗血清特异性，结果显示在约31 KDa处出现特异性条带，阴性对照无条带，表明OmpK蛋白抗血清具有良好的特异性且抗血清效价达到1∶1600(图7)。

M：蛋白marker；1～4：抗血清稀释倍数分别为为1∶400，1∶800，1∶1200，1∶1600；5: 阴性血清(1∶400倍稀释)

2.6 体外模拟OmpK蛋白抗血清与嗜水气单胞菌相互作用

由图8显示，随着抗血清稀释倍数的增大，OmpK蛋白抗血清与嗜水气单胞菌的结合能力逐渐减弱，当抗体滴度达到1∶3200时，仍可检测到两者的相互作用。由此可见，OmpK蛋白抗血清与嗜水气单胞菌在体外存在相互作用，OmpK蛋白可能存在较好的抗原性。

图8 OmpK蛋白抗血清与嗜水气单胞菌体外相互作用

2.7 OmpK蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用

采用Western blot检测OmpK的差异表达情况(图9)。实验组与对照组OmpK蛋白均检测到特异性条带，且随着血浆浓度的降低OmpK的表达呈现出上调趋势，推测OmpK可能为孔道蛋白，通过关闭孔道，以有效抵抗血浆杀菌因子进入细胞而杀伤菌体。

1～5：血浆稀释倍为1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32；6：未稀释血浆；7：阳性对照(生理盐水)

3 讨 论

嗜水气单胞菌是一种广泛存在的病原体，对人和动物均有致病性[14]，主要可引发鱼类的气单胞菌败血症，也可导致人类胃肠炎和皮肤感染。在该菌的防治方面，以往的抗生素手段疗效好，但极易引起机体耐药性[6,15]。疫苗免疫作为一种安全且无毒害的防治手段[16]，备受青睐。目前处于研究热点的渔用疫苗包括亚单位疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗等[17]。其中亚单位疫苗是以免疫活性的片段作为组分，免疫作用稳定持久，是一种潜在的高效疫苗[18]，而嗜水气单胞菌的外膜蛋白具有较强的免疫原性[19]，可作为疫苗开发的候选成分。本研究构建了的嗜水气单胞菌OmpK蛋白表达菌株，制备了OmpK蛋白多克隆抗体，为疫苗研发奠定基础。

生物信息学可准确预测蛋白质亲缘关系、理化性质及高级结构等[20]。本研究发现OmpK蛋白在气单胞菌属间同源性较高，表明OmpK蛋白在不同种类的气单胞菌间所参与的耐药机制可能相近；OmpK免疫机体产生的抗体，可能同时抵御多种气单胞菌的感染。二级结构以无规则卷曲为主(47.50%)，因其易扭曲盘旋，暴露在蛋白外层，有利于优势细胞抗原表位的形成[21]，为研发广谱性OmpK蛋白疫苗制剂提供理论依据。

多克隆抗体制备周期短且效果好，常应用于蛋白的免疫功能研究[22]。本研究以纯化的蛋白免疫小鼠制备了特异性较好的OmpK蛋白多克隆抗体，且抗体效价达到1∶1600倍，为嗜水气单胞菌OmpK蛋白的功能研究与疫苗开发提供良好的生物学基础材料。

蛋白的外源表达由于受到宿主的影响，其最佳表达条件往往是唯一的，实验发现菌液OD600为1.0，IPTG终浓度为0.5 mmol/L，28 ℃诱导8 h，OmpK蛋白获得最大表达。研究发现，高浓度的IPTG和长时间诱导会抑制细菌生长，影响蛋白表达[23-24]，与本实验发现低浓度IPTG(0.5 mmol/L)，8 h诱导一致；此外，低温诱导利于活性蛋白的表达，可有效降低包涵体产生[25]，本研究也发现低温(28 ℃)更有助于OmpK表达，为工业大量获取OmpK蛋白提供参考依据。

体外模拟OmpK蛋白多克隆抗体与嗜水气单胞菌的识别作用，结果显示两者在体外存在相互作用，表明获得了特异性较好的OmpK蛋白多克隆抗体。细菌在机体内被清除往往需要有相应的抗体与其互相识别[26]，本研究在体外模拟蛋白抵抗鱼血浆杀菌作用，发现细菌进入鱼体后，OmpK呈现为下调表达量，推测OmpK蛋白可能为孔道蛋白，通过关闭通道以抵抗血浆因子识别，从而保护细菌，这也与所预测的三维结构为桶状相吻合。有研究发现大肠杆菌外膜蛋白TolC携带外排基因，属于外排泵蛋白，表现为上升表达量以抵抗药物作用[27]，这与本研究中OmpK蛋白呈现的下调机制恰好相反，本研究为揭示相关疾病的发生机理奠定基础。

4 结 论

OmpK在气单胞菌属间蛋白同源性较高，可能在多种气单胞菌间具有免疫保护作用；并获得其理化性质和形态结构。成功表达并纯化OmpK蛋白，获得其最佳表达条件，制备了特异性较好的OmpK多克隆抗体，效价达到1∶3200，OmpK抗血清对嗜水气单胞菌具有较好的免疫识别作用，具有较好的抗原性；OmpK可通过下调表达实现抵抗鱼血浆对嗜水气单胞菌的杀菌作用，为嗜水气单胞菌OmpK蛋白的生物学功能提供理论支持。