枯草芽孢杆菌BEST195的碳水化合物酶类(CAZymes)的分布与进化分析

祝友朋，韩长志

(西南林业大学生物多样性保护学院/云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224)

【研究意义】近些年，学术界关于植物病原真菌[1]、卵菌[2]、细菌[3]中碳水化合物活性酶类(Carbohydrate-Active Enzymes, CAZymes)的研究已涉及预测、遗传关系分析、蛋白互作等[3-4]以及在植物与病原菌互作过程中的功能等领域[5]，并呈现出较快的增长趋势[6]。枯草芽孢杆菌BEST195作为纳豆菌的一种，是纳豆生产中重要的工业菌株之一，CAZymes蛋白影响着纳豆的产量，但尚不清楚枯草芽孢杆菌BEST195的CAZymes的情况。【前人研究进展】有关CAZymes形成CAZy数据库(http://www.cazy.org/)[7]，主要涉及以下6大类，糖苷水解酶(GHs)、糖基转移酶(GTs)、多糖裂解酶(PLs)、碳水化合物酯酶(CEs)、辅助酶类家族(AAs)以及碳水化合物绑定结构(CBMs)[6]。CAZy数据库是专业描述碳水化合物功能域相关酶的数据库[7-8]，为开展细菌中CAZymes的注释与聚类分析提供了基础[9]。到目前为止该数据库中GH、GT、PL、CE、AA、CBM类别的家族数量分别为167、110、40、17、16、86个，其数量相比之前均有一定的增加。枯草芽孢杆菌BEST195(Bacillussubtilissubsp.nattoBEST195)是日本三菱化学生命研究所从纳豆中分离到的枯草芽孢杆菌纳豆亚种[10]，主要产生多聚γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid, γPGA)[11]，然后将大豆发酵为纳豆。目前，国内外学者对纳豆菌的研究集中在代谢产物纳豆激酶[12]、抗菌作用[13]等方面，细菌分泌蛋白的研究主要有香蕉细菌性软腐病菌[14]、茄青枯病菌[15]、丁香假单胞杆菌番茄致病变种[16]等植物病原细菌及枯草芽孢杆菌XF-1生防菌[17]等。【本研究切入点】前人根据枯草芽孢杆菌BEST195的全基因组序列[18-19]与其他枯草芽孢杆菌菌株进行比较基因组分析，发现γPGA的产生与鞭毛蛋白FliF有直接关系[11]，且CAZymes影响着γPGA的产量，进而影响着纳豆的产量。【拟解决的关键问题】前期通过分泌蛋白的预测明确枯草芽孢杆菌BEST195含有102个分泌蛋白[20]，然而，尚不清楚该菌中CAZymes的情况。利用在线工具CAT(CAZymes Analysis Toolkit)进行预测，网址为(http://cricket.ornl.gov/cgi-bin/cat.cgi)[9]，同时对上述CAZymes进行遗传关系及相互作用分析，为今后研究枯草芽孢杆菌BEST195的CAZymes在纳豆发酵时的功能提供理论基础。

1 材料与方法

首先，利用CAT[9]对前期获得枯草芽孢杆菌BEST195的102个分泌蛋白[18]开展CAZymes预测，获得CAZymes，然后对CAZymes进行遗传关系分析，先利用ClustalX[21]进行多重比对，随后利用MEGA 7.0[22]采用邻近法构建系统发育树[23]；最后，利用STRING v.10[24]开展蛋白相互作用预测，明确CAZymes蛋白之间的相互关系。

2 结果与分析

2.1 CAZymes的预测分析

枯草芽孢杆菌BEST195中含有57个CAZymes，其中尤以GH最多，数量为27个，所占比例为47.37%；其次是CBM，为21个，所占比例为36.84%；PL、CE、GT的数量分别为4、2、1，所占比例分别为7.02%、3.51%、1.75%。同时，该菌中仅含有一种复合型酶类，即GH/CBM，数量为2个，所占比例为3.51%(图1)。

图1 枯草芽孢杆菌BEST195中CAZymes的分布情况

2.2 GH的数量

进一步分析57个CAZymes中的糖基水解酶蛋白，共有14种，其中GH23数量最多，为6个；其次是GH18，数量为5个，上述蛋白所占比例为40.74%；再次，还涉及GH3、GH47、GH53、GH73等类型，数量均为2个，所占比例合计为29.63%(图2)。此外，还包括GH1、GH13、GH16、GH19、GH30、GH32、GH46、GH102等类型(图2)。

图2 枯草芽孢杆菌BEST195中糖基水解酶蛋白的分布情况

2.3 CBM的数量

碳水化合物绑定结构蛋白含有CBM5、CBM9、CBM12、CBM13、CBM32、CBM50、CBM57、CBM66共8种类型，其中CBM50的数量最多，为11个，所占比例为52.38%；其次是CBM5，数量为3个，再次是CBM32，数量为2个(图3)，其他5种类型CBM的数量均为1个。

图3 枯草芽孢杆菌BEST195中碳水化合物绑定结构蛋白的分布情况

2.4 PL、CE和GT的数量

多糖裂解酶含有PL1、PL3、PL9、PL11共4种类型，数量均为1个，其ID分别是gi|428278239、gi|428281087、gi|428281263、gi|674709029；碳水化合物酯酶含有CE4、CE12此2种类型，数量均为1个，其ID分别为gi|428278282、gi|428281562；糖基转移酶仅有GT2这1个，其ID为gi|428279498。

2.5 复合型CAZymes的数量

在所有CAZymes中，发现了2个复合类型：GH102/CBM50、GH32/CBM66，其ID分别为gi|428279554、gi|428280145。

2.6 CAZymes的遗传关系分析

通过对上述CAZymes的遗传关系进行分析，明确存在GH/PL/CBM、GH/CBM、GH/CBM/CE/PL、GH/CBM/CE/PL/GT等类型，但前期所预测的复合类型仅涉及GH102/CBM50、GH32/CBM66 2类，还有GH/PL/CBM、GH/CBM/CE/PL、GH/CBM/CE/PL/GT 3类未能预测(图4)。对上述3大类进行分析，明确上述类别中均含有GH、CBM、PL，还有部分CE、GT也存在其中。此外，对于GH/CBM类别，可以很清楚的发现，存在2个重要的分支，并未聚在一起(图4)，其原因有待进一步通过试验进行验证。

图4 枯草芽孢杆菌BEST195中CAZymes之间的遗传关系分析

2.7 CAZymes蛋白的相互关系分析

利用STRING v.10[22]分析枯草芽孢杆菌BEST195的CAZymes蛋白的相互作用网络，发现数据库中尚缺少枯草芽孢杆菌BEST195的有关数据，利用同源比对方式，以枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168)中同源蛋白进行后续研究，发现大部分CAZymes蛋白已经明确其结构特征(图5中大球)，因此，为今后进一步开展大多数CAZymes功能分析及相互作用关系研究提供了重要的理论支撑。另外，yvnB(YP_005562834.1)、yngK(YP_005561221.1)、yfhK(YP_005560079.1)、yckB(YP_005559509.1)、ybbC(YP_005559318.1)、lytB(YP_005562902.1)、tcyA(YP_005559538.1)、yurO(YP_005561206.1)、yvbX(YP_005560187.1)、yocH(YP_005561289.1)、wapA(YP_005563320.2)等蛋白，其结构特征尚未明确(图5)，但在与其他已知关系蛋白中，发挥着重要的作用。

图5 枯草芽孢杆菌BEST195中CAZymes蛋白的相互关系分析

3 讨 论

一般而言，CAZymes是植物病原真菌、细菌中非常重要的一类蛋白，在其生长发育过程中有着不可或缺的作用[3-4,25]。但有关非植物病原菌CAZymes的研究报道较少[26-27]。枯草芽孢杆菌BEST195的分泌蛋白依据CAT网站获得其CAZymes，是否能完全预测枯草芽孢杆菌BEST195的CAZymes，需要后续进行验证。另外，前人所开展CAZymes的具体类别有5个，分别是GH、GT、PL、CE、CBM，而根据最新的分类类别，有6个，分别是GH、GT、PL、CE、AA、CBM，这是CAZymes最新分类方面的报道。

前期通过分泌蛋白预测和CAZymes预测得到枯草芽孢杆菌XF-1的分泌蛋白的数量为104个，CAZymes的数量为58个，其中26个GH、21个CBM以及2个CE、3个PL、2个GT、4个GH/CBM，枯草芽孢杆菌BEST195的分泌蛋白的数量为102个，CAZymes的数量为57个。2个枯草芽孢杆菌菌株间的分泌蛋白数量和CAZymes数量较为相近，但CAZymes的种类存在一定的差异，主要表现为枯草芽孢杆菌BEST195含有GH1、GH16、GH30、CBM13、PL9、PL11、GT39，主要功能为分解木聚糖、葡聚糖、甘露糖和鼠李糖等，枯草芽孢杆菌XF-1含有GH43、GH68、CBM26、CBM63、GH3/CBM50、GH13/CBM26，主要功能为分解木糖、蔗糖、淀粉和纤维素等。枯草芽孢杆菌BEST195作为纳豆发酵菌，其作用为产生γPGA，进而将大豆发酵成纳豆，枯草芽孢杆菌XF-1作为生防菌，其作用为抑制病原菌生长，诱导植物产生抗病性和促进植物生长，菌株发挥的作用与CAZymes的种类差异息息相关。但造成CAZymes的种类差异是否与菌株的生长环境及其发挥的作用有关有待于验证。

通过对枯草芽孢杆菌BEST195的CAZymes开展遗传关系分析以及蛋白相互关系分析，明确CAZymes的分类有待于向更细、更小的方向进行，前人分析也有相同结果[25]，同时，对于CAZymes蛋白之间的互作关系有待明确。

4 结 论

利用CAT进行预测，明确枯草芽孢杆菌BEST195中CAZymes的数量为57个，分别为27个GH、21个CBM、2个CE、4个PL、1个GT和2个GH/CBM。同时，对上述CAZymes开展了遗传关系分析及蛋白之间互作研究，明确CAZymes蛋白之间具有相互作用的关系。为枯草芽孢杆菌BEST195的CAZymes的功能分析以及彼此之间相互作用研究打下了坚实的理论基础。