山西贡梨粗多糖的提取工艺优化及其抗氧化活性研究

朱 丽，陈婉婷，白志军，张 颖，庞杏林，袁 俊，熊 岑

(1 广州市疾病预防控制中心，广州，510000；2 广东石油化工学院生物与食品工程学院，广东茂名，525000)

梨是我国主要水果之一，栽培历史悠久、分布地区广泛，山西贡梨是其中的一个主要品种。有研究证明，梨可滋肺养肺，将梨与冰糖一起熬炖食用有止咳的效果[1]。梨含B族维生素、配糖体及鞣酸等成分，能祛痰止咳，对咽喉有养护作用。梨的糖类物质和多种维生素都比较容易被人体吸收，梨有助于增进食欲。梨含有多酚类物质能够防止动脉粥样硬化，梨富含的果胶有助于消化通便。梨的多糖主要贮藏在果肉中。多糖的提取方法有多种，且每种方法所对应的多糖提取率也各不相同，已有研究表明，从原料中提取出来的主要是杂多糖。原料的新鲜度也会影响到多糖的提取率，所以为了保证多糖含量，必须选择新鲜的果实。

梨的粗多糖有多种提取方法[2]，溶剂提取法，利用相似相溶的原理，合理优化提取溶剂从而达到高提取效率。李文君等[3]采用正己烷法有效将枸杞色素提取出来。酶提取法广泛地被用于各种活性物质的提取，由于酶对相应的植物细胞的细胞壁和蛋白质有酶解的功能，为了能够获得更高的活性物质提取率，人们常采用酶提取法[4]。Song等[5]利用酶法α-淀粉酶、纤维素、果胶酶或蛋白酶(LLEP-PR)提取荷叶多糖。超声提取法所需时间更短，设备简单，节约成本，具有独特的优势。周恩红等[6]利用超声提取法来研究大别山区金樱子多糖含量时，进行了单因素优化提取条件，同时也设计了正交试验对多糖含量进行检查。植物多糖提取后经过分离工艺如脱色法、分步沉淀法、盐析法或柱层析法进行分离纯化。植物多糖的含量测定有苯酚-硫酸法[7]、液相色谱法[8]。

植物多糖能够抑制清除自由基，医学上常利用植物多糖的抗氧化活性治疗因自由基积累所造成的疾病[9-10]。粗多糖具有降血糖、防治糖尿病、降血脂、抗血凝等作用。梨作为一种常见水果，其粗多糖、黄酮、多酚等活性物质的抗氧化性研究具有医学应用价值。植物多糖的抗氧化性研究方法有DPPH自由基清除法[11]、ABTS自由基清除法[12]、羟基自由基清除法[13]。羟基自由基的清除有邻二氮菲法和水杨酸法两种最为常用的方法。薛娟等[13]在对中药黄柏多糖成分进行含量测定及抗氧化活性研究时发现，黄柏的多糖能够有效地清除DPPH自由基和·OH，清除率均呈现出良好的量效关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验的山西贡梨购买自大型超市，采购时选择外表完整、气味正常、看起来成熟度适中的新鲜果实。本研究所涉及的试剂名称、规格以及生产厂家见表1，实验主要仪器和设备见表2。

表1 材料与试剂

表2 仪器与设备

1.2 试验方法

1.2.1 山西贡梨多糖的提取工艺流程

葡萄糖标准曲线的绘制。采用苯酚-硫酸法测定多糖。配制好1 mg/mL葡萄糖溶液，稀释得0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液。分别移取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、1.8 mL的0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液于刻度试管中，用蒸馏水定容至2 mL的刻度线，再加入1.0 mL 6%苯酚和2.0 mL浓硫酸充分摇匀后静置半小时，在485 nm处，测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

粗多糖的超声辅助提取。将新鲜山西贡梨去皮，取约5.0 g果肉于研钵中捣碎，转移至100 mL小烧杯加入适量蒸馏水超声，然后离心、弃渣留液。向滤液中加入95%乙醇沉淀粗多糖，放于4 ℃的冰箱中静置8 h以上，过滤取下层沉淀物，以8 000 r/min离心10 min。将沉淀物定容至100 mL，摇匀后放置在4 ℃的冰箱。参照苯酚-硫酸法，使用葡萄糖标准曲线的回归方程式来计算各吸光度对应的多糖溶液浓度，最后依据下面的公式求出相对应的粗多糖溶液的得率。

(1-1)

式中，C表示粗多糖含量(g/L)；V表示提取液体积(mL)；D表示样品溶液稀释倍数；W表示样品的质量(mg)。

1.2.2 单因素试验

根据1.2.1的粗多糖超声辅助提取步骤进行以下条件的操作。

不同提取温度对粗多糖提取率的影响。固定单因素：料液比取1∶40(g/mL)，提取时间20 min，超声功率120 W。在固定的单因素条件下，测定50、60、70、80、90 ℃的提取温度对山西贡梨粗多糖提取率所带来的不同影响。

不同提取时间对粗多糖提取率的影响。固定单因素：料液比为1∶40(g/mL)，提取温度80 ℃，超声功率120 W。在固定的单因素条件下，测定10、20、30、40、50 min的提取时间对山西贡梨粗多糖提取率所带来的不同影响。

不同料液比对粗多糖提取率的影响。固定单因素：提取时间20 min，提取温度80 ℃，超声功率120 W。在固定的单因素条件下，测定1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)的料液比对山西贡梨粗多糖提取率所带来的不同影响。

不同超声功率对粗多糖提取率的影响。固定单因素：料液比1∶40(g/mL)，提取温度80 ℃，提取时间20 min。在固定的单因素条件下，测定100、110、120、130、140 W的超声功率对山西贡梨粗多糖提取率所带来的不同影响。

1.2.3 正交试验

通过单因素试验的测定选出最优的单因素水平，再在其附近分别择取两个水平作为正交试验的优化水平，然后在此基础上设计出一个正交试验。各因素与水平的排列可以参照L9(34)正交表，然后根据设定好的提取条件来进行试验，最后对正交试验的结果进行讨论分析，选出最佳的优化提取条件。正交试验的操作步骤根据1.2.1的粗多糖超声辅助提取步骤。

1.2.4 山西贡梨粗多糖清除自由基试验

山西贡梨粗多糖清除·OH的测定。依据Fenton原理，测定山西贡梨粗多糖清除·OH的清除率。预先配制好的1 mg/mL的山西贡梨粗多糖溶液分别取0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL放置在带刻度试管中，然后再用蒸馏水定容到4 mL，充分摇匀，得到浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的粗多糖溶液。加入9 mmol/L FeSO4溶液以及9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液各0.5 mL，充分摇匀后，再加入8.8 mmol/L H2O2溶液0.5 mL，将试管转移到37 ℃的水浴槽中加热半小时取出冷却至室温，在波长为510 nm处测定其吸光度Ai。同上述步骤再另取一组试管加入试剂，将8.8 mmol/L H2O2溶液0.5 mL改成加入0.5 mL的蒸馏水，测其吸光度Aoi。取一根空管为空白组，即另取一支试管将4 mL的山西贡梨粗多糖溶液用蒸馏水代替，作为空白对照，测其吸光度Ao。每组测3次取平均值。将抗坏血酸作为试验的阳性对照组，最后再依据公式1-2计算出相应的·OH清除率：

·OH清除率(%) = [1- (Ai-Aoi)/Ao]×100%

(1-2)

山西贡梨多糖清除DPPH·的测定。DPPH·是一种比较稳定的自由基，它的有机溶液通常会显示紫色。当遇到抗氧化剂时自由基含量会发生变化，溶液在波长517 nm处会出现最大的吸收峰。根据这一原理进行山西贡梨粗多糖抗氧化活性测定。先从预先配制好的1 mg/mL的山西贡梨粗多糖溶液分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，用蒸馏水定容到2 mL，得到浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。在各试管中分别加入2.0 mL DPPH溶液(乙醇配制，浓度0.16 mmol/L)摇匀后放入25 ℃的水浴槽中15 min。在波长为510 nm处测定其吸光度Aa。同上述步骤再另取一组试管将加入2.0 mL DPPH溶液改成加入2.0 mL的蒸馏水，其对应的吸光度为Aua表示。用一根空白试管作为空白组，即将2.0 mL的山西贡梨粗多糖溶液用蒸馏水替代，并作为空白对照，测其吸光度用Au表示。每组浓度测定3次，平均值作为试验的参考值。以抗坏血酸作为试验的阳性对照，最后根据公式1-3计算出相应的DPPH·清除率：

DPPH·清除率(%) = [1- (Aa-Aua)/Au]×100%

(1-3)

2 结果与讨论

2.1 山西贡梨粗多糖的提取与分析

2.1.1 葡萄糖标准曲线图

由图1可知，标准曲线的回归方程为y=0.012 9x-0.008 1，相关系数R2= 0.999 1。y表示测试的吸光度，x表示测试中对应的葡萄糖的质量浓度(μg/mL)，在一定的范围内，吸光度呈现出良好线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线

2.1.2 单因素试验分析

提取温度对山西贡梨粗多糖提取率的影响。由式1-1可知，山西贡梨粗多糖提取率与吸光度成正比。由图2可知，温度小于70 ℃时，随着温度升高，粗多糖提取率增加较快。当温度大于70 ℃时，随温度增加，粗多糖提取率增加缓慢。由于温度升高，溶液的热效率逐渐提高，溶液中的分子运动也逐渐变得剧烈，此状态下细胞内的粗多糖更加容易溶解出来，但温度过高可能影响其稳定性，因此选取60、70、80 ℃作为正交试验中提取温度的因素水平。

图2 提取温度对粗多糖提取率的影响

提取时间对粗多糖提取率的影响。由图3可知，当提取时间小于20 min时，随着时间增加，粗多糖的提取率逐渐增加。当提取时间为20 min时，溶液中的山西贡梨粗多糖提取率达到最大值13.73%。当提取时间大于20 min时，随着提取时间增加粗多糖提取率开始降低，可能由于加热时间长会导致一部分的多糖被降解，致使多糖提取率下降。20 min作为单因素试验的最佳参考时间，因此选择10、20、30 min作为正交试验中提取时间的因素水平。

图3 提取时间对粗多糖提取率的影响

料液比对山西贡梨粗多糖提取率的影响。由图4可知，料液比小于1∶20时，随着料液比增大，粗多糖提取率也逐渐增大。料液比为1∶20时，粗多糖的提取率达到峰值10.01%。当料液比大于1∶20时，随着料液比增加，粗多糖提取率开始降低。在适当范围内，随着提取溶剂的增加，目标物萃取率增大，但是增加溶剂的同时也会增加其他物质的溶解量，从而影响有效成分的提取率。当多糖的溶出量达到平衡时，过多的溶剂可能会对多糖的含量造成影响，而且还会使其他的杂质溶入到溶剂中，进而降低了粗多糖的提取率。1∶20作为单因素试验最佳参考料液比，因此选择1∶10、1∶20、1∶30作为正交试验中料液比的因素水平。

图4 料液比对粗多糖提取率的影响

超声功率对山西贡梨粗多糖提取率的影响。由图5可知，当超声功率小于120 W时，随着超声功率的增大，山西贡梨粗多糖提取率逐渐增加。当超声功率为120 W时，山西贡梨粗多糖的提取率达到峰值12.49%。当超声功率大于120 W时，随着超声功率增加，粗多糖提取率逐步下降。可能由于超声波破坏了细胞壁的结构，增加了粗多糖溶出量，但超声也伴随着机械振动，振动加快了多糖的溶解速率，从而导致粗多糖提取率降低。本研究选择110、120 、130 W作为正交试验中提取功率的因素水平。

图5 超声功率对粗多糖提取率的影响

2.2 正交试验结果

单因素提取水平的基础上，选择提取温度、提取时间、超声功率、料液比进行正交试验优化，以确定山西贡梨粗多糖的提取最佳工艺条件。用A、B、C、D分别表示提取温度、提取时间、超声功率、料液比，绘制试验因素与水平的关系表，具体的水平选择可见表3。参照表3的试验因素与水平的关系可以设计出L9(34)正交试验，具体的正交试验因素水平以及正交试验的各因素水平的测试结果见表4。

表3 粗多糖提取试验因素与水平

由表4可知，提取温度为80 ℃、提取时间为30 min、超声功率为120 W、料液比为1∶10(g/mL)的因素水平时，山西贡梨粗多糖的提取率仅为10.08%。由极差结果R值可知，各因素水平变化对试验结果影响由大到小为：A>B>C>D，即提取温度>提取时间>超声功率>料液比，其中A对应的最优水平为A1，B对应的最优水平为B2，C对应的最优水平为C2，D对应的最优水平为D2，最优的提取工艺组合为A1B2C2D2。最佳条件为试剂2号对应的粗多糖提取率最高：提取温度为60 ℃、提取时间为20 min、超声功率为120 W、料液比为1∶20(g/mL)的因素水平时，山西贡梨粗多糖的提取率15.43%。

表4 正交试验因素水平及结果分析

2.3 山西贡梨粗多糖的抗氧化能力

2.3.1 ·OH清除活性研究

由图6可知，在试验所选的浓度范围之内，山西贡梨粗多糖以及抗坏血酸(Vitamin C)对羟基自由基均表现出较好的清除效果。在粗多糖的浓度为1.0 mg/mL时，山西贡梨粗多糖对羟基自由基表现出最好的清除能力。抗坏血酸属于一种比较强的抗氧化剂，在较低的浓度就能达到非常好的清除效果。在浓度同为0.2 mg/mL的情况下，抗坏血酸对羟基自由基的清除率已经高达95.7%，而此时山西贡梨粗多糖对羟基自由基的清除作用最小，只有24.7%。当将浓度统一调至1.0 mg/mL时，抗坏血酸对羟基自由基的清除作用变化比较微小，清除率为95.9%，而山西贡梨粗多糖在此浓度下，其对羟基自由基的影响变化比较显著，清除率增大至78.6%。在较低的浓度下，抗坏血酸就能够表现出较强的清除能力，而且作用能力比山西贡梨粗多糖的作用能力强，而山西贡梨粗多糖只有在浓度较高的情况下才能表现出较好的清除效果。该现象可能由于山西贡梨粗多糖的纯度不高，抗坏血酸是经过纯化提取的固体晶体，同时也属于强氧化剂，所以在低浓度下就能起到较好的清除作用。粗多糖的·OH清除能力证明了粗多糖具有降血糖、防治糖尿病、降血脂、抗血凝等作用。

图6 山西贡梨粗多糖对·OH清除作用

2.3.2 DPPH·自由基清除活性

由图7可知，一定浓度范围内，山西贡梨粗多糖及抗坏血酸对羟DPPH·均表现出良好的清除作用。抗坏血酸在较低的浓度下即表现出较好的清除率，随着浓度增加清除效率变化缓慢，浓度为0.1 mg/mL时，它对DPPH·的清除率高达95.5%；当浓度继续升高到0.5 mg/mL时，DPPH·清除率为95.7%。山西贡梨粗多糖浓度在0.1～0.3 mg/mL范围内时，对DPPH·的清除率随着粗多糖的浓度增大而增大，当浓度增至0.3 mg/mL时，对DPPH·的清除率达到峰值87.9%，当继续增大粗多糖浓度时，粗多糖对DPPH·的清除能力出现减弱的现象，当浓度达到试验最大浓度0.5 mg/mL时，其对应的DPPH·的清除率为87.3%。受粗多糖含量及分子空间位阻影响，抗坏血酸对DPPH·的清除能力比山西贡梨粗多糖强。

图7 山西贡梨粗多糖对DPPH·的清除作用

3 结论与讨论

本研究以单因素试验为基础，通过正交试验设计优化了山西贡梨粗多糖超声辅助提取的工艺。结果表明，超声辅助提取山西贡梨粗多糖的提取温度、提取时间、超声功率以及料液比对粗多糖的提取率均表现出较为显著的影响。提取温度对粗多糖提取率的影响最大，其次是提取时间和超声功率，合理的料液比对提取率的影响不明显。经过正交试验的条件优化，可得出山西贡梨粗多糖最佳的提取条件为：提取温度60 ℃，提取时间为20 min，料液比1∶20(mg/mL)，超声功率120 W，山西贡梨粗多糖的提取率为15.43%。本研究采用的超声辅助提取法与传统的热水提取法相比，超声提取法能有效地降低提取的最佳温度，加快了粗多糖的提取效率，简化粗多糖提取的步骤。在低温条件下可以保证多糖结构的完整性，短时间低温的提取可以减少更多能量的损耗，提高了多糖的提取效率。

通过对山西贡梨粗多糖的抗氧化活性试验结果表明，山西贡梨粗多糖的提取物与抗坏血酸均能够有效地清除DPPH·自由基和·OH自由基，山西贡梨粗多糖对DPPH·和·OH自由基均有较强的清除能力，在一定范围内粗多糖浓度与两种自由基的清除能力均呈线性相关。目前国内外有关山西贡梨粗多糖抗氧化活性的科学研究甚少，该数据可为山西贡梨精加工产品的研制提供一定的前期理论基础，同时为进一步研究山西贡梨的营养成分保持提供前期数据基础。