木霉P3.9菌株对枇杷根际细菌多样性及其群落组成的影响

鲁海菊，李晓静，冯 渝，沈云玫，陶宏征

(红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自，661199)

枇杷内生木霉TrichodermaatrovirideP3.9菌株抗菌谱广[1]，发酵工艺简单[2-3]，可抑制枇杷根腐病菌[4]，并能成功定殖于枇杷根际[5]及其植株内[6]，且抑制枇杷根际土壤真菌[7]及枇杷内生真菌[8]，促进枇杷根际细菌生长[9]，对枇杷植株有促生防病作用，具有广阔的开发应用前景。

随着高通量技术的发展，甜瓜[10]、丹参[11-12]、桑树[13]、麻山药[14]、胡萝卜[15]、白桦[16]、苜蓿[17]、西洋参[18]、红花[19]、水稻和小麦[20]、樱桃[21]、骆驼蓬[22]、枸杞[23]、大花杓兰[24]根际土壤细菌群落多样性得以揭示；辣椒健康植株与枯萎病株[25]、西洋参健康植株与西洋参根腐病病株[26]根际土壤细菌多样性差异性得以明确。陆续有报道碳[27]、氮[28]、生物炭[29-31]、秸秆[32-35]、木醋液[10]、除草剂使它隆[36-37]、生防菌[38]添加对农田土壤细菌群落的影响，发现土壤添加木醋液[10]、生物炭[27，29-30]、生防细菌[38-39]能增加细菌多样性，除草剂使它隆[36-37]能降低土壤细菌多样性。为了明确木霉P3.9菌株对枇杷根际土壤细菌多样性及群落结构的影响，揭示其对枇杷植株的促生防病机理，本文采用高通量测序技术，分析添加木霉P3.9菌株对枇杷根际土壤细菌多样性及群落结构的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株为内生木霉P3.9菌株Trichodermaatroviride，保存于红河学院植物病理学标本室。PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖17 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌悬液接种根际土壤的方法 将P3.9菌株在PDA平板上28 ℃培养5 d，加无菌水用粉碎机搅拌均匀，制成孢子菌悬液1×106cfu/mL，将其灌根于苗龄1年的枇杷盆栽嫁接苗，每株500 mL；灌根等量清水做为对照，重复3次，常规肥水管理。

1.2.2 枇杷根际土样采集 两个灌根处理第10、20、30、40、50、60、70、80、90天，用土钻5点取样法随机采集深度5～20 cm的根际土样，过200目筛，用四分法混匀备用。

1.2.3 枇杷根际土壤总DNA提取 用Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒按照说明提取。

1.2.4 设计并合成引物接头 根据illumina Miseq高通量测序要求，进行双向测序，设计目标区域和带有5′Miseq接头-barcode-测序引物-特异引物-3′的融合引物。

F：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特异引物-3′，R：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特异引物-3′。

1.2.5 PCR扩增和产物纯化定量及均一化 用微基生物科技(上海)有限公司通用流程进行。

1.2.6 MiSeq高通量测序 54个样品送微基生物科技(上海)有限公司测序。

1.2.7 数据统计 Operational Taxonomic Units(OTU)聚类：利用UPARSE在97%相似度下进行聚类，得到OTU的代表序列；利用UCHIME将PCR扩增产生的嵌合体从OTU代表序列中去除；16S和ITS采取和已有的嵌合体数据库进行比对的方法去除嵌合体。16S嵌合体数据库为gold database(v20110519)，ITS嵌合体数据库为UNITE(v20140703)，分为ITS全长、ITS1和ITS2，按测序区域进行选择。使用usearch_global方法将所有序列比对回OTU代表序列，得到每个样品在每个OTU的丰度统计表。通过mothur(classify.seqs)软件将OTU代表序列与数据库比对进行物种注释，置信度阈值设置为0.8。使用软件USEARCH和mothur去除没有注释结果的OTU，去除注释结果不属于分析项目中的物种。

群落结构组成柱状图：基于每个样品在每个OTU的丰度统计表，利用R语言工具作图。

anova_oneway组间差异比较：选择p<0.05的物种绘制柱形图，每个柱子为差异物种的相对丰度，误差线为标准误，其中*代表0.01

Beta多样性分析组间差异比较：基于Unifrac分析得到的距离矩阵，通过层次聚类(Hierarchical cluatering)中的非加权组平均法UPGMA 构建进化树，分析添加木霉P3.9菌株处理与未添加对照枇杷根际细菌进化上的相似性及差异性。

2 结果与分析

2.1 对根际土壤细菌多样性及群落丰度的影响

由表1可知，10～90 d期间，木霉P3.9菌株灌根处理的枇杷根际土壤细菌Shannon和Simpson指数与对照(清水)差异不显著；除了第10天外，木霉P3.9菌株灌根处理的枇杷根际土壤细菌Chao、ACE指数显著小于对照(清水)，说明木霉P3.9菌株处理使枇杷根际细菌群落丰富度略有下降，但不影响枇杷根际土壤细菌的多样性。

表1 木霉P3.9菌株灌根对枇杷根际土壤细菌多样性及群落丰度的影响

2.2 对根际土壤细菌群落组成的影响

2.2.1 对根际土壤细菌群落门分类地位的影响 图1显示枇杷根际土壤细菌主要包括15个已知门和3个不能够注释到的门水平。其中，物种丰度占前5位的门依次是Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和Acidobacteria。图2显示木霉P3.9菌株灌根处理与对照(清水)枇杷根际土壤细菌在门分类水平上差异显著，导致6个门枇杷根际土壤细菌物种丰度发生变化。其中，优势门的物种丰度未变化，Ignavibacteriae显著降低(0.01

注：*、**、***分别表示0.01

注：每柱从左往右依次是T1_1、T1_2、T1_3、T2_1、T2_2、T2_3、T3_1、T3_2、T3_3、T4_1、T4_2、T4_3、T5_1、T5_2、T5_3、T6_1、T6_2、T6_3、T7_1、T7_2、T7_3、T8_1、T8_2、T8_3、T9_1、T9_2、T9_3、CK1_1、CK1_2、CK1_3、CK2_1、CK2_2、CK2_3、CK3_1、CK3_2、CK3_3、CK4_1、CK4_2、CK4_3、CK5_1、CK5_2、CK5_3、CK6_1、CK6_2、CK6_3、CK7_1、CK7_2、CK7_3、CK8_1、CK8_2、CK8_3、CK9_1、CK9_2、CK9_3，分别表示木霉P3.9菌株(T)和清水(CK)灌根处理第10、20、30、40、50、60、70、80、90天的根际土样。图3、图5、图7、图9、图11和图13同。

2.2.2 对根际土壤细菌群落纲分类地位的影响 图3显示，枇杷根际土壤细菌主要包括27个纲和1个不能够注释到的纲水平。其中，物种丰度占前5位的纲依次是不能够注释到的纲、Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria。图4显示木霉P3.9菌株灌根处理与对照(清水)的枇杷根际土壤真菌在纲分类水平上差异显著，导致枇杷根际土壤细菌12个纲物种丰度发生变化，其中，优势纲物种丰度未变化。Chloroflexia、Acidimicrobiia、Thermomicrobia、Ignavibacteria 4个纲显著降低(0.01

图3 在纲水平上木霉P3.9菌株和清水灌根对枇杷根际土壤细菌群落组成的影响

图4 在纲水平上木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根际土壤细菌群落组成差异分析

2.2.3 对根际土壤细菌群落目分类地位的影响 图5显示枇杷根际土壤细菌包括41个已知目和1个不能够注释到的目。其中，物种丰度占前5位的目依次是不能够注释到的目、Propionibacteriales、Anaerolineales、Xanthomonadales、Sphingobacteriales。图6显示木霉P3.9菌株灌根处理与对照(清水)的枇杷根际土壤细菌在目分类水平上差异显著，导致枇杷根际土壤细菌27个目的物种丰度发生改变，其中，优势目的物种丰度未发生改变。Pseudonocardiales、Micrococcales、Rhizobiales、Herpetosiphonales、Acidimicrobiales、Streptomycetales、Bradymonadales、Sphaerobacterales、Thermogemmatisporales 9个目显著降低(0.01

图5 在目水平上木霉P3.9菌株和清水灌根对枇杷根际土壤细菌群落组成的影响

图6 在目水平上木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根际土壤细菌群落组成差异分析

2.2.4 对根际土壤细菌群落科分类地位的影响 图7显示枇杷根际土壤细菌主要包括49个已知科和1个不能够注释到的科。其中，物种丰度占前5位的依次是不能够注释到的科、Nocardioidaceae、Anaerolineaceae、Xanthomonadaceae和Planctomycetaceae。图8显示木霉P3.9菌株灌根处理与对照(清水)的枇杷根际土壤细菌在科分类水平上差异显著，导致枇杷根际土壤细菌36个科物种丰度发生改变，其中，优势科的物种丰度未改变。Micrococcaceae、Xanthobacteraceae、Herpetosiphonaceae、Streptomycetaceae、Lamiaceae、Microbacteriaceae、Archangiaceae、Sphaerobacteraceae、Rickettsiaceae、Bacteroidaceae、Brevibacteriaceae、Oscillochloridaceae12个科显著降低(0.01

图7 在科水平上木霉P3.9菌株和清水灌根对枇杷根际土壤细菌群落组成的影响

图8 在科水平上木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根际土壤细菌群落组成差异分析

2.2.5 对根际土壤细菌群落属分类地位的影响 图9显示枇杷根际土壤细菌主要包括46个已知属和1个不能够注释到的属。其中，物种丰度占前5位的依次是不能够注释到的属、Aeromicrobium、Gemmatimonas、Terrimonas和Rhizobium。图10显示木霉P3.9菌株灌根处理与对照(清水)的枇杷根际土壤细菌在属分类水平上差异显著，导致枇杷根际土壤细菌50个已知属的物种丰度发生改变，其中优势属的物种丰度未改变。Nocardioides、Herpetosiphon、Allokutzneria、Pseudolabrys、Streptomyces、Lamia、Sorangium、Archangium、Agromyces、Shinella、Rubellimicrobium、Nitrolancea、Pseudaminobacter、Castellaniella和Actinocorallia15个属显著降低(0.01

图9 在属水平上木霉P3.9菌株和清水灌根对枇杷根际土壤细菌群落组成的影响

图10 在属水平上木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根际土壤细菌群落组成差异分析

2.2.6 对根际土壤细菌群落种分类地位的影响 图11显示枇杷根际土壤细菌主要包括8个已知种，3个不能够注释到的种和21个未培养种，水陆两栖细菌1种。其中，物种丰度占前5位的种均为不能够注释到的种或未培养种。说明土壤细菌种类极其复杂，可以进一步探索未知种。图12显示木霉P3.9菌株灌根处理与对照(清水)的枇杷根际土壤细菌在种分类水平上差异显著，导致枇杷根际土壤细菌17个已知种物种丰度发生改变。其中，Allokutzneriaalbata、Pseudaminobacterdefluvii、Streptomycesprasinus、Legionellaquinlavanii、Phytomonosporaendophytica5个种显著降低(0.01

图11 在种水平上木霉P3.9菌株和清水灌根对枇杷根际土壤细菌群落组成的影响

图12 在种水平上木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根际土壤细菌群落组成差异分析

2.3 对根际细菌多样性的持续影响

由图13可知，调查的90 d期间，30 d之前木霉P3.9菌株灌根处理与对照(清水)细菌多样性聚为1大枝，50～90 d聚为另一大枝，第40天横跨在2大枝之间。其中，第10天、第50天木霉P3.9菌株灌根处理与对照(清水)各自聚为一小枝，20～30 d、60～70 d和80～90 d也各自聚为一小枝，第40天木霉P3.9菌株灌根处理与对照未能完全聚在同一小枝上。说明木霉P3.9菌株灌根处理30～40 d内对枇杷根际细菌多样性有一定影响，其余时间木霉P3.9菌株灌根处理与对照(清水)的枇杷根际细菌多样性趋于一致。

图13 不同时间段木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根际土壤细菌多样性差异分析

3 结论与讨论

试验结果表明，枇杷根际土壤细菌优势菌群为变形杆菌门Proteobacteria、放线菌纲Actinobacteria、丙酸杆菌目Propionibacteriales、类诺卡氏菌科Nocardioidaceae、气微菌属Aeromicrobium。优势门为变形杆菌门，与甜瓜根际添加木醋液[10]、土壤添加生物炭[27，30，34-35]及添加生防细菌[38]结果一致。枇杷根际添加木霉P3.9菌株30 d之内，不改变枇杷根际细菌多样性，30～40 d之内多样性略有下降，50～90 d之间，枇杷根际细菌多样性又恢复正常水平。说明枇杷根际添加木霉P3.9菌株对其根际细菌多样性及优势菌群种类无不良影响，反而可以改善非优势菌群的丰度。枇杷根际添加木霉P3.9菌株致使硝化螺旋菌属Nitrospira增加，与生物炭添加[30，38]、加气灌溉[40]结果一致，能提高氮肥利用率[41]，与秸秆添加结果相反[33]。亚硝化螺菌属Nitrosospira增加，与施肥[42]结果一致。亚硝化单胞菌属Nitrosomonas增加，此属细菌是芦苇等植物根际[43]及土壤[44]氨氧化细菌。亚硝化球菌属Nitrosococcus增加，此属具有将氨转化硝酸的能力[45]。以上4个属细菌有利于促进土壤铵态氮向硝态氮转化[46]，能间接提高土壤肥力。金黄杆菌属Chryseobacterium增加，此属菌株具有Cd吸附能力[47]，修复Cd污染土壤。Micromonospora、Archangium、Nonomuraea3个属增加，这3个属[48-50]能产生抗生素，抑制病原菌。拟无枝酸菌属Amycolatopsis、Smaragdicoccus、土壤红杆菌属Solirubrobacter、芽球菌属Blastococcus、嗜血杆菌Azohydromonas、红球菌属Rhodococcus、Bauldia、诺卡氏菌属Nocardia、帕维特杆菌属Parviterribacter和矿生菌属Fodinicola急剧下降。红球菌属Rhodococcus能引起牧草病害[51]，Legionella[52]为土壤嗜肺菌，Streptomyces[53]会引起马铃薯疮痂病，这3个属为有害细菌。其他属在植物根际土壤中的功能尚未明确。数量发生剧烈变化的6个种在土壤中的功能尚未见报道，有待进一步研究。

综上所述，木霉P3.9菌株灌根处理促使枇杷根际有益细菌增加，间接增强土壤肥力，对枇杷植株表现出促生[6]作用。修复Cd污染土壤，致病菌减少，防治枇杷根腐病应用前景广阔。