一种生物膜表面唾液酸的染色和定量方法*

张柏惠 ， 杨晓倩 ， 邹 翔 ， 曲中原 ， 崔琳琳 △， 郭守东 △

［1哈尔滨商业大学药学院（药物工程技术研究中心），黑龙江哈尔滨150076；2潍坊医学院药学院脂代谢与动脉粥样硬化研究室，山东潍坊261053］

材料和方法

1 主要仪器试剂和材料

LEICA CM1850 冰冻切片机和DHG-9240A 型烘箱（上海精宏实验设备有限公司）；BX51（Olympus）；Axio Vert.A1倒置显微镜（Zeiss）。NaIO4和荧光素-5-氨基硫脲（fluorescein-5-thiosemicarbazide，FTSC）购自Sigma-Aldrich；甘油购自北京诺博莱德科技有限公司；OCT（optimal cutting temperature）包埋液购自Tissue-Tek；青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）、伊红、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）和吐温20 购自索莱宝生物科技有限公司；四季青胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；RPMI-1640 培养液购自Gibco；苏木精购自如吉生物科技公司。

2 动物和细胞

SPF 级8周龄雄性载脂蛋白E 基因敲除（apolipoprotein E-deficient，ApoE-/-）小鼠和 C57BL/6 小鼠各 6只，体重为（22±2）g，均购自北京华阜康生物科学有限公司，许可证编号为SCXK2014-0004。饲料购自购自北京华阜康生物科技有限公司。小鼠RAW 264.7巨噬细胞购自上海博耀生物技术有限公司；小鼠乳腺癌4T1 细胞和人肝母细胞瘤HepG2 细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

3 主要方法

3.1 试剂配制方法 （1）PBS溶液：配制0.01 mol/L的 PBS，调节 pH 值为 7.4，置于冰箱 4 ℃备用；（2）PBS-T 溶液：取配好的 PBS 以 500∶1 的比例加入吐温20，摇匀；（3）FTSC 工作液：取配好的 PBS 将 FTSC 配制为 100 μmol/L 的 FTSC 工作液；（4）NaIO4工作液：用双蒸水溶解NaIO4，配制成1 mmol/L 的NaIO4溶液；（5）DAPI 工作液：用 PBS 将 DAPI 配制成5mg/L 的工作液；（6）甘油工作液：用配好的PBS 将甘油原液配制成1 mmol/L 的工作液；（7）苏木精储备液A：1 g 苏木精加入100 mL 无水乙醇，40 ℃微热溶解；（8）苏木精储备液B：取30%的无水氯化铁溶液4 mL 加入1 mL 浓盐酸和 95 mL 蒸馏水混匀；（9）苏木精工作液：在使用时将 A 液与 B 液 1∶1 混合，需过滤后使用，限4 h内使用，4 h后工作液易被氧化变色。

3.2 细胞培养 细胞复苏后采用25 cm2的培养瓶，在37 ℃、5%CO2培养箱中采用含有10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素的RPMI-1640 培养液培养。实验中，将灭菌后的盖玻片置于6 孔板中，接种对数生长期的细胞，让细胞在盖玻片上贴壁，方便后续染色。

3.3 细胞染色条件优化 HepG2 细胞生长到60%时，弃去培养液用PBS 轻轻润洗3 次，每孔加入1.5 mL 的NaIO4工作液，在4 ℃冰箱静置20 min。取1.5 mL 甘油工作液加到六孔板中，随后用冷的PBS 润洗3次。为探讨不同时间对染色效果的影响，每孔内加入 1 mL 的 FTSC 工作液分别染色 10、20、40 和 90 min，再用 PBS 轻洗 3 次。接下来，取适量的 DAPI 工作液滴加到细胞上，室温避光静置5 min，对细胞核进行复染，用PBS-T 润洗3 次后拍片。观察染色情况，选取最佳染色时间后，进行平行实验以确定方法的可靠性。

3.4 优化后的细胞染色 待细胞生长到60%时，弃去培养液用PBS 轻轻摇晃洗涤3 次，每孔各加入1.5 mL NaIO4工作液，在4 ℃冰箱静置20 min。取1.5 mL甘油工作液加到6 孔板中。随后用冷的PBS 轻洗3次。加入1 mL FTSC 工作液，避光反应40 min，用PBS 轻洗3 次。取适量DAPI 工作液滴加到细胞上，室温避光静置5 min，对细胞核进行复染，用PBS-T轻洗3 次后拍片。图像采用荧光倒置显微镜自带的分析软件获得荧光强度值，进而量化唾液酸含量。在实验中应以仅加入FTSC 处理组作对照，用于排出可能的假阳性结果或用以扣除背景。

3.5 H2O2对细胞表面唾液酸的影响 对数生长期的细胞，接种到放置有盖玻片的6 孔板中，随机分为对照组和H2O2处理组（100 μmol/L H2O2），细胞培养24 h后进行染色分析。

学习少数民族民间乐器，主要是通过利用实物或者图片以及欣赏乐器演奏音乐来认识。当幼儿听到乐器演奏的音乐引起其兴趣后，再利用实物或者图片让幼儿能够对乐器的构造有初步的认识，帮助幼儿理解和记忆。选择幼儿欣赏的音乐作品时，不但要使其符合当前的教学要求，同时还要使其与幼儿的理解能力及感知能力相符，并且在选择音乐时还要能够使用到相应的乐器。所以，在选择乐器时应该选取那些音乐长度适中且结构简单并利于携带的。

3.6 动物饲养 该动物实验得到潍坊医学院实验动物伦理委员会的批准。6 只C57BL/6 小鼠给予正常低脂饲料喂养，6 只ApoE-/-小鼠给予高脂饲料（含有21%脂肪和0.15%胆固醇）喂养。小鼠自由饮食，饲养8 周，环境湿度为45%～60%，饲养温度为22 ℃。

3.7 动物取材ApoE-/-小鼠和C57BL/6 小鼠脊椎脱臼处死后解剖，在体视显微镜下用眼科镊子和眼科剪剔除主动脉周围的脂肪，取带有主动脉弓2 mm 左右（即主动脉窦瓣膜的位置）的心脏，去除多余组织后切除心尖，使切口处与主动脉弓切面平行。用OCT 包埋液包埋，使主动根朝上，放入-80 ℃冰箱或液氮中速冻。剩余主动脉从中间纵向剖开，放入4%的多聚甲醛中固定2 h。C57BL/6小鼠肝脏和小肠样本均裁切后采用OCT包埋液包埋，并速冻。

3.8 切片及唾液酸染色 使用LEICA CM1850切片机，在-18～-22 ℃环境下切片，厚度为5 μm。在切片上滴加4%的多聚甲醛固定2 min，放入蒸馏水稍作停留后取出，重复3次。取100 μL 的NaIO4工作液滴加到切片组织上，放于冰箱4 ℃静置20 min。取甘油工作液0.5 mL，滴加到切片上。随后用冷的PBS润洗3 次，每次5 min。在组织上滴加FTSC 工作液，放入37 ℃培养箱静置40 min，避光条件下用PBS 轻洗3 次，每次5 min。避光条件下，取适量DAPI 工作液覆盖到组织切片上，室温静置5 min，随后用PBS-T缓慢洗涤2 min，甘油封片后拍片。

3.9 实验假阳性结果的考察 为排除实验可能存在的假阳性结果，采用小鼠乳腺癌4T1 细胞和C57BL/6 小鼠小肠切片进行实验。随机分为4 组，分别为空白对照组、NaIO4组（不加FTSC 荧光染料）、FTSC 组（不加入NaIO4）和正常实验组（按照优化后条件，依次加入NaIO4和FTSC 染料）。以上各组均采用DAPI对核进行染色定位。

3.10 主动脉染色方法 取小鼠胸主动脉从中间纵向剖开后，浸泡到2 mL NaIO4工作液中，冰箱4 ℃静置。30 min 后，取出主动脉并浸泡在3 mL 甘油工作液中，接着采用冷的PBS洗涤3次，每次5 min。将主动脉展平固定到载玻片上，在组织上滴加FTSC 工作液，放入37 ℃培养箱中避光静置40 min，并在避光条件下用PBS 洗涤3 次，每次5 min。室温避光滴加DAPI 工作液覆盖主动脉内表面10 min，用PBS-T 缓慢洗涤3次，每次3 min。最后采用显微镜拍照。

3.11 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色 组织切片，在4%的多聚甲醛中固定2 min，放入蒸馏水稍作停留后取出，重复3 次。采用苏木精工作液染色10 s 后，迅速用自来水冲洗30 s 左右。自来水流速缓慢，沿切片上方空白处冲洗，不可直接冲到组织切片上。再采用蒸馏水稍作漂洗，待切片晾干后，采用伊红染液染色10 s，蒸馏水涮洗5 下。最后，采用甘油明胶封片后拍照。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0进行统计学分析。数据以均数±标准差（mean±SD）的形式表示。两组间均数比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 染色条件的确立

采用NaIO4平行处理HepG2细胞，处理后的细胞与FTSC反应不同时间后的荧光图片如图1所示。实验结果显示，HepG2 细胞与 FTSC 反应 10 min，细胞膜表面的绿色荧光信号很弱；随着FTSC 孵育时间的延长，细胞表面的绿色荧光显著增强，统计分析结果显示FTSC 孵育20 min 时的荧光强度较孵育10 min时的荧光强度增加了约3 倍（P＜0.01），孵育40 分钟时的荧光强度较孵育20 min 时的荧光强度增加了约31%（P＜0.01），但反应40 min 时的荧光信号与孵育90 min 时的荧光强度无显著性差异。因此，在考察的时点内，FTSC 孵育时间为40 min 时效果最佳。在下述的细胞和组织切片的唾液酸染色过程中，如无特殊说明，FTSC的孵育时间均采用40 min。

Figure 1.Typical images and fluorescence intensity of HepG2 cells treated with FTSC for different time（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs 10 min group；##P＜0.01 vs 20 min group.图1 HepG2细胞经FTSC处理不同时间后的荧光图片及荧光强度分析

为排除染色过程中可能存在的假阳性结果，我们采用小鼠乳腺癌4T1 细胞进行了平行比对实验，实验结果如图2A 所示，空白对照组和仅采用NaIO4处理组未见明显的绿色荧光信号，仅采用FTSC 孵育的细胞可见微弱的绿色荧光背景信号。统计分析结果显示，采用优化后的实验条件进行唾液酸染色时的荧光信号是仅采用FTSC 处理组的16 倍左右（P＜0.01），是仅采用NaIO4处理组或空白对照组的40 倍左右（P＜0.01）。在C57BL/6 小鼠小肠切片的实验中也得到了类似的结果（图2B）。统计分析结果表明，采用优化后的实验条件，小肠切片的荧光强度是仅采用NaIO4处理组或空白对照组的41 倍（P＜0.01），是仅采用FTSC处理组的9.3倍（P＜0.01）。

Figure 2.Images and fluorescence intensity analysis of sodium metaperiodate（NaIO4）-treated and untreated mouse breast cancer 4T1 cells（A）and small intestine sections of C57/BL/6 mice（B）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.The scale bar=200 μm.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group.图2 高碘酸钠处理和未处理对小鼠乳腺癌4T1细胞和C57/BL/6小鼠小肠切片染色的影响

2 H2O2对细胞表面唾液酸的影响

采用优化后的染色方法，小鼠RAW 264.7 巨噬细胞膜表面的唾液酸呈现出强烈的绿色荧光，细胞核呈现出蓝色荧光；H2O2处理组的荧光强度显著低于未处理组（P＜0.01），见图3。

Figure 3.Images and fluorescence intensity analysis of H2O2-induced desialylation of RAW 264.7 macrophages（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.The RAW 264.7 macrophages were treated with 100 μmol/L H2O2 for 24 h.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group.图3 H2O2诱导的RAW 264.7巨噬细胞去唾液酸化结果

在小鼠乳腺癌4T1 细胞和人肝母细胞瘤HepG2细胞中，我们也得到了类似的结果：H2O2处理可分别下调4T1 细胞和HepG2 细胞表面的荧光强度约31%和74%（P＜0.01），见图4、5。

Figure 4.Images and fluorescence intensity analysis of H2O2-induced desialylation of mouse breast cancer 4T1 cells（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.The 4T1 cells were treated with 100 μmol/L H2O2 for 24 h.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group.图4 H2O2诱导的小鼠乳腺癌4T1细胞去唾液酸化结果

Figure 5.Images and fluorescence intensity analysis of H2O2-induced desialylation of human hepatoblastoma HepG2 cells（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.The HepG2 cells were treated with 100 μmol/L H2O2 for 24 h.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group.图5 H2O2诱导的人肝母细胞瘤HepG2细胞去唾液酸化结果

3 组织切片染色

小鼠主动脉根部切片的实验结果如图6 所示。采用优化后的条件进行唾液酸染色后，可清晰地观察到C57BL/6 小鼠主动脉窦瓣膜结构完整，主动脉壁、瓣膜及周边组织均有唾液酸着色，其中主动脉壁染色最为鲜明；值得注意的是，ApoE-/-小鼠主动脉根部可清晰地观察到动脉粥样硬化斑块的形态。上述组织形态与HE 染色所观察到的组织形态高度一致。

Figure 6.Typical images of the aortic root sections from C57/BL/6 and ApoE-/- mice after sialic acid staining and HE staining（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green）and nuclei were labeled with DAPI（blue）.HE staining was performed to further evaluate the histological location and structural characteristics of the aortic root sections.The cardiac valves and the peripheral tissues，especially the aortic wall，were labeled as green fluorescence by FTSC in C57/BL/6 mice.Furthermore，the atherosclerotic plaques were labeled as green fluorescence by FTSC in ApoE-/- mice.图6 小鼠主动脉根部切片的唾液酸染色和常规HE染色结果

C57BL/6 小鼠肝脏和小肠的切片经唾液酸染色后，亦可观察到其切片表面唾液酸着色鲜明，细胞排列整齐、结构清晰，见图7。肝脏和小肠经唾液酸染色后所观察到的组织结构特征亦与HE 染色图片的组织形态高度一致。

Figure 7.Images of liver and small intestine sections from C57BL/6 mice after sialic acid staining and HE staining（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.HE staining was performed to further evaluate the histological location and structural characteristics of the sections.The structural characteristics of the liver and small intestine sections after sialic acid staining were consistent with those after HE staining.图7 C57BL/6小鼠肝脏和小肠切片的唾液酸染色和常规HE染色结果

4 胸主动脉染色

如图8 所示，经唾液酸染色后，C57BL/6 和ApoE-/-小鼠的主动脉内壁结构完整，着色清晰。其中，C57BL/6 小鼠主动脉内壁纹理清晰，细胞排列整齐有序；而ApoE-/-小鼠主动脉内壁可见明显的皱褶，纹理结构紊乱无序。

Figure 8.Typical images of the inner wall of thoracic aortas from C57BL/6 and ApoE-/- mice（scale bar=100 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.The cells arranged well in the inner aorta wall of the C57 BL/6 mice，whereas the cells were irregular in the inner aorta wall of the ApoE-/-mice.图8 C57BL/6和ApoE-/-小鼠的胸主动脉内壁唾液酸染色结果

讨 论

唾液酸在组织内和血浆中广泛分布，其在疾病发生发展中易发挥着重要作用。有研究者认为血清唾液酸水平与炎症反应呈正相关，可作为心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）的生物标志物［10-11］。在心肌梗死患者中，血清唾液酸浓度显著高于正常人，而且血清唾液酸浓度随着机体年龄的增大而上升［12］。此外，从人血液中分离获得的一种唾液酸含量较低的脂蛋白可以诱导胆固醇在主动脉平滑肌细胞中积累［13］，而胆固醇在血管壁的聚集是导致斑块形成的重要原因。糖尿病患者与健康人脂蛋白上的

唾液酸水平亦存在显著差异［14］。目前，唾液酸与CVD 之间的关系仍存有不同见解，本课题组前期研究显示外源性补充唾液酸可促进胆固醇逆向转运，并显著降低甘油三酯的水平［15-16］。病理状态下的血清唾液酸水平升高可能是机体的一种补偿机制，该推论尚待进一步确证。

鉴于唾液酸在生理和病理状态下的重要功能，已有不同的研究团队建立了不同的唾液酸定性和定量检测方法。例如，研究者借助同位素标记和唾液酸在核磁共振中所呈现出的不同相关信号（H3-C2、H3-C1和C1-C2）可检测细胞或蛋白表面的唾液酸［3］。Colsch 等［17］利用基质辅助激光解吸/电离质谱技术可绘制小鼠脑冠状切片中的唾液酸鞘糖脂的分布和定位情况。上述方法的确为唾液酸的定性和定量研究提供了可借鉴的技术手段，但实验过程中需要高端的仪器和相应的技术人员做支撑，且不易获得直观的图像资料。我国南京大学的研究团队采用糖纳米粒和功能化量子点技术可高效计数细胞表面的唾液酸分子并将该标记方法应用于细胞计数和细胞表面唾液酸的荧光分析［18］。此外，亦有研究团队报道了将糖基（含叠氮、酮或炔基的非天然底物）插入到细胞糖蛋白中，再通过化学拼接手段实现报告基团对唾液酸化糖蛋白成像的技术。但上述该方法需要制备相应的材料，不利于唾液酸染色和定量的便利性需求［19-21］。美国和英国研究者通过高碘酸盐氧化使唾液酸分子C-7位成醛，将生成的醛基用氨氧基或酰肼生物素标记，然后用FITC 标记的亲和素染色［6-7］。后来，我国西北大学的研究者则建立了轻度NaIO4氧化与FTSC 荧光探针结合的技术，进一步在细胞水平上简化上述方法，并证明了简化后的方法与前期报道［6-7］的染色效果相当［8］。

FTSC 是一种具有亮绿色荧光的生物标记分子，对活细胞无毒并在生理条件下对醛基具有较高的化学选择性［22-23］。借助唾液酸的结构特征，轻度NaIO4氧化可选择性地将醛基引入到生物膜表面的唾液酸分子上［5-6］。从理论上来讲，该染色方法不会出现假阴性结果。此外，前期文献采用不表达唾液酸的Lec-2 细胞排除了该方法出现假阳性结果的可能性［8］。该方法的缺点之一在于：倘若样本自身存在醛基，则存在与FTSC 结合产生假阳性结果的可能性；但上述假阳性结果可通过在实验中仅加入FTSC处理组作为对照，并在统计分析中扣除背景以消除干扰。本研究借助前期报道［8］，在验证其在细胞水平上简便有效的基础上，成功地对小鼠组织切片和主动脉内膜表面的唾液酸分子进行了荧光标记。优化后的实验步骤可对细胞和组织表面的唾液酸进行荧光染色和量化分析，且不易产生假阳性结果。该方法的另一缺点在于采用荧光定量分析的准确性方面，该缺点可采用多次平行实验减小误差，在细胞实验中则可采用流式细胞术进行量化分析以减小误差［8］。

氧化应激与各种疾病密切相关。本研究结果显示，采用H2O2处理后的细胞，其细胞膜表面的唾液酸水平显著降低。该研究结果与前期报道唾液酸在抗氧化方面的生物活性相一致［24-25］，也与H2O2可导致分子去唾液酸化相符合［9］。

本研究采用动脉粥样硬化模型小鼠证实，轻度NaIO4氧化结合FTSC 可实现对主动脉窦瓣膜处生成的动脉粥样硬化斑块的荧光染色，且斑块及周边组织结构清晰，与HE 染色的组织形态高度一致；同时观察到在小鼠主动脉瓣膜壁上唾液酸的着色更为突出，表明唾液酸在血管壁的含量比周边组织要高。本研究进一步的主动脉内壁染色的结果亦表明，血管内壁有较丰富的唾液酸分布。更为重要的是，通过唾液酸染色结果比对分析可清晰地观察到ApoE-/-小鼠较C57BL/6 小鼠主动脉血管内壁出现不规则的褶皱，这是动脉内壁早期斑块形成的典型特征。该实验结果与ApoE-/-小鼠主动脉根部出现的动脉粥样硬化斑块表型一致。因此，本研究结果为检测CVD基础病变动脉粥样硬化的发生与发展过程提供了一种直观、有效的技术手段。

此外，本研究结果证实，该方法可成功用于检测肝脏和小肠组织的唾液酸分布状态，且染色过程能很好地维持组织切片的原有形态。从技术层面上来讲，该染色方法可对多种生物膜表面的唾液酸进行原位标记，具有应用于各种细胞、组织和器官等含有唾液酸样本中实现定性和定量分析的潜力。