木瓜益生菌发酵饮料工艺优化及品质分析

姚瑞祺，高 敏，葛含静

（1.杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西学前师范学院，西安 710061）

光皮木瓜［Chaenomelessinensis（Thouin）Koehne］，又名榠楂、木瓜，属于蔷薇科木瓜属植物，原产中国，主要分布于陕西、湖北等地，其果实成熟后色泽金黄，个大肉多，气味芳香，具有良好的营养价值和保健功能。近年来，全国木瓜的种植面积和产量均不断上升，以陕西省白河县为例，截至2017年底，种植面积已达9 333 hm2，其中挂果面积4 667 hm2，年产量2.6万t。伴随木瓜种植规模不断扩大，亟需延长产业链，大力发展深加工。

在食品工业中，木瓜已被成功地开发为木瓜酒、木瓜醋等［1，2］，但鲜见相关益生菌饮料的开发报道。研究证实［3-5］，益生菌能竞争性抑制肠道致病菌的生长，促进人体消化吸收、提高人体免疫力；柴晓霞［6］将双歧杆菌三联活菌用于治疗溃疡性结肠炎，临床效果显著。马幸等［7］发现益生菌能够有效促进非酒精性脂肪性肝病患者的细胞因子表达恢复正常。目前，益生菌被广泛应用于食品工业生产中，如酸乳、泡菜的加工等，益生菌果汁饮料亦成为研究热点，其安全性已经得到有效验证。

木瓜富含糖、VC［8，9］及矿物质［10］等营养物质，另外还含有多种有机酸、酚类物质［11，12］，是益生菌发酵的理想基质。但由于木瓜原料酸度较高，直接接种未经驯化的益生菌株会导致其发酵性能大大下降，难以快速生长繁殖，也无法产生良好的营养和风味物质。本研究利用驯化后的植物乳杆菌及类干酪乳杆菌为混合发酵菌种，复配后加入木瓜汁中进行发酵，以活菌数和产酸量为评价指标，对木瓜益生菌发酵饮料工艺进行优化；同时，对发酵前后木瓜汁的总酸、游离态酚和结合态酚进行比较，分析益生菌发酵对木瓜汁品质的影响。本研究可为木瓜的益生菌发酵提供理论基础及饮料产业化开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

光皮木瓜：采自陕西省白河县木瓜园。

植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）、类干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei），购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

MRS培养基购自北京缘生化科技有限公司。

1+1混合酶：由果胶酶与纤维素酶按等量配比，果胶酶与纤维素酶购自山东济宁和信生物技术有限公司。

DNP-9272恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；LDZM-80KCS-Ⅲ立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；PHS-25型pH计，上海雷韵试验仪器制造有限公司；FA1204C电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；TG16台式高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 木瓜汁的制备 将木瓜洗净，去除种子后切成2 cm×2 cm的方块，立即投入2倍体积的85℃热水中软化、护色15 min，趁热打浆。调整浆液温度为45℃，按照0.25%的用量投入1+1混合酶酶解3 h，过滤，调整糖度至15%，在121℃条件下灭菌20 min，冷却待用。

1.2.2 驯化培养基的制备［13］将木瓜汁与MRS培养基混合，木瓜汁所占比例分别为20%、40%、60%、80%、100%。121℃条件下灭菌20 min，冷却待用，制得5个浓度的驯化培养基。100%浓度的驯化培养基即纯木瓜汁。

1.2.3 益生菌的驯化与复配 利用5个浓度的驯化培养基进行益生菌的传代培养，直至驯化成功。选取植物乳杆菌与类干酪乳杆菌配比2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2进行复配试验，确定最佳复配比例并用于后期的发酵试验。

1.2.4 发酵单因素试验 选取发酵温度22、26、30、34、38、42℃，复合菌种用量1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，发酵时间6、12、18、24、30、36 h，以产酸量和活菌数为指标，通过控制其他因素水平不变，仅改变其中一个因素的水平来进行单因素试验。

1.2.5 正交试验 以产酸量和活菌数为指标，在单因素试验的基础上，设计正交试验，得出木瓜益生菌发酵饮料最优工艺。正交试验因素与水平见表1。

表1 发酵试验因素与水平

1.2.6 酚类物质的提取 参照田新惠等［14］的方法，略作改动。采用最优工艺发酵木瓜汁，分别收集木瓜汁、发酵饮料中的游离态酚和结合态酚，以便后期测定含量。

1）游离态酚的提取。分别称取木瓜汁及发酵液5.00 g，加入20 mL 80%甲醇，振摇10 min，5 000 r/min高速离心10 min，取上清液。重复3次，合并上清液。将上清液过0.22μm滤膜，分别用80%甲醇定容至100 mL容量瓶备用。

2）结合态酚的提取。分别收集高速离心后的沉淀物，在氮气保护下加入20 mL 2 mol/L NaOH振摇水解1 h，用浓盐酸调节水解液pH至2.0。用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于45℃下旋转蒸发至干，用80%甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶备用。

1.2.7 测定方法 产酸量：以乳酸计，采用GB/T 12456—20008（pH电位法）；活菌数：GB 4789.35—2016食品微生物实验乳酸菌检验；维生素C：GB 5009.86—2016（2，6-二氯靛酚滴定法）；总酚：Folin-Ciocalteu比色法。

1.3 数据整理与分析

采用SPSS 17.0、Excel 2007软件进行数据分析，数据结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 益生菌的驯化与复配结果

利用不同木瓜汁浓度的驯化培养基对益生菌进行传代培养，传代效果见图1。100%浓度的培养基中益生菌活菌数达7.00 lg（cfu/mL）以上时，便可认为驯化成功［15，16］。由图1可知，植物乳杆菌和类干酪乳杆菌在纯木瓜汁中的活菌数均达7.00 lg（cfu/mL）以上，达到了驯化标准。

图1 益生菌驯化效果

为获得植物乳杆菌、类干酪乳杆菌的适宜配比，以产酸量和活菌数为指标，对复合益生菌在木瓜汁中的发酵情况进行了试验，结果见图2。从图2可以看出，植物乳杆菌与类干酪乳杆菌在配比为4∶6时活菌数与产酸量均达到最高点，发酵效果最佳，因此植物乳杆菌与类干酪乳杆菌的适宜配比为4∶6。

图2 复合益生菌配比效果

2.2 单因素试验结果

2.2.1 温度对木瓜汁发酵的影响 温度对木瓜汁发酵的影响见图3。在22～42℃，随着发酵温度的升高，活菌数和产酸量均呈先上升后下降的趋势。不同的是，活菌数在34℃时达到最高后急剧下降（P＜0.05），而产酸量则下降趋势平缓（P＞0.05）。这可能是因为长时间高温发酵，复合菌种出现老化、甚至死亡，导致活菌数下降明显，产酸量变化也不显著。综合考虑，适宜的发酵温度为34℃。

图3 温度对发酵效果的影响

2.2.2 菌种用量对木瓜汁发酵的影响 菌种用量对木瓜汁发酵的影响见图4。当菌种用量低于2.5%时，随着菌种用量的增加，发酵液中的活菌数及产酸量均逐渐增加（P＜0.05），但当菌种用量超过2.5%后，增大菌种量则对活菌数与产酸量均影响不显著（P＞0.05）。因此，适宜的接种量为2.5%。

图4 菌种用量对发酵效果的影响

2.2.3 时间对木瓜汁发酵的影响 发酵时间对木瓜汁发酵的影响见图5。在发酵时间6～24 h，产酸量和活菌数均明显上升。24 h以后产酸量虽有少量增长，但变化不显著（P＞0.05）。活菌数18～24 h趋于平稳，30～36 h出现下降趋势，这可能是因为复合菌种的生长曲线已经接近衰亡期。综合考虑，适宜的发酵时间为24 h。

图5 时间对发酵效果的影响

2.3 正交试验结果

在单因素试验的基础上，设计3因素3水平L9（33）正交试验，试验结果及极差分析见表2，数据方差分析见表3。由表2和表3可知，以活菌数为指标，各个因素均显著（P＜0.05），因素主次顺序依次为菌种用量（B）＞温度（A）＞时间（C），优组合为A3B2C2，即菌种用量2.5%，发酵温度36℃，发酵时间24 h；以产酸量为指标，温度（A）极显著（P＜0.01），菌种用量（B）和时间（C）显著（P＜0.05），因素主次顺序为温度（A）＞菌种用量（B）＞时间（C），优组合为A3B3C2，即发酵温度36℃，菌种用量3.0%，发酵时间24 h。

表2 复合益生菌发酵正交试验结果

表3 正交试验方差分析

由于评价指标不同，优组合也不尽相同，主要表现在菌种用量（B）方面，分别有B2和B3两种可能性。综合考虑活菌数与产酸量2个指标，在B2条件下活菌数最高，对产酸量的影响与B3差异不是特别大，且能降低菌种使用量，节约成本，最终确定A3B2C2为最优组合，即发酵温度36℃，菌种用量2.5%，发酵时间24 h。在此条件下，进行3次平行验证试验，木瓜益生菌发酵饮料中的活菌数平均值为8.79 lg（cfu/mL），产酸量平均值为12.2 g/kg。

2.4 木瓜汁发酵前后品质分析

以正交试验最优工艺得到的木瓜益生菌发酵饮料和原始木瓜汁为测定对象，对木瓜汁发酵前后的总酸、游离态酚和结合态酚等指标进行比较，分析益生菌发酵对木瓜汁品质的影响，结果见表4。总酸可直接反映发酵饮料的品质，通过总酸的增幅也可反映益生菌的代谢能力［17］。游离态酚和结合态酚均有良好的抗氧化活性，但在相同剂量下，游离态酚的抗氧化活性要优于结合态酚［18］。

从表4可以看出，益生菌发酵产生了新的有机酸，总酸含量增幅高达8.01%。另外，益生菌发酵使得木瓜汁中游离态酚和结合态酚的数量及比例发生明显变化（P＜0.05）。游离态酚由原来的4.21 mg/g升为5.83 mg/g，增加了38.5%；结合态酚由原来的1.56 mg/g降为0.75 mg/g，减少了51.9%。这可能是因为在发酵过程中产生了中间代谢物质，使得结合态酚的部分糖苷键、酯键发生分解，释放出游离态酚，其作用机理尚需进一步研究。

表4 益生菌发酵对木瓜汁品质的影响

3 小结

通过逐级耐酸驯化，植物乳杆菌与类干酪乳杆菌均达到了驯化标准，可成功地应用于木瓜汁的发酵。经优选，两种益生菌的复配比例为4∶6。在单因素试验的基础上，以产酸量和活菌数为指标，对发酵温度、接种量、发酵时间进行了L9（33）正交试验设计，得出木瓜益生菌发酵饮料的最佳工艺条件为发酵温度36℃，菌种用量2.5%，发酵时间24 h，各因素均显著。在此条件下，饮料中的活菌数平均值为8.79 lg（cfu/mL），产酸量平均值为12.2 g/kg。复合益生菌发酵使得木瓜汁的品质发生了较大的改善，表现为总酸含量增加8.01%，游离态酚增加38.5%，结合态酚减少51.9%。试验成功开发了木瓜复合益生菌发酵饮料，解决了益生菌驯化、发酵工艺等技术难题，可为木瓜的益生菌发酵提供理论基础及饮料产业化开发提供参考，具有较好的应用推广效果。