硅和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛抗寒性的影响

丁久玲，郑 凯，唐冬芬，席刚俊，史 俊

（江苏农林职业技术学院，江苏 句容 212400）

铁皮石斛（Dendrobium candidum）是中国传统的名贵中药材，具有健胃、滋阴、润肺、明目、清热解毒、提高免疫力等功效。低温会抑制铁皮石斛幼苗的成活和生长，是影响其生存与分布的主要因素。因此，增强铁皮石斛幼苗的抗寒能力，寻找一种有效缓解低温伤害的方法是提高铁皮石斛幼苗成活率及产量的关键，亦是铁皮石斛种植和生产中亟待解决的问题之一。

硅是地壳中第二丰富的元素，大量研究表明，硅有益于植物的生长发育，能显著缓解低温胁迫对小麦、水稻、黄瓜、乌塌菜等植物［1-5］的不良影响，从而提高植物的抗寒性。硒（Se）是植物生长发育中有益的营养元素，参与植物体内的氧化还原反应，清除脂质过氧化物等自由基，减少胁迫对生物膜等造成的机体过氧化损伤，从而降低胁迫带来的伤害，在植物抗逆中的作用越来越受到重视。涉及硒提高植物抗寒性的报道较少，研究表明适宜浓度的硒可以减弱低温对草莓、萝卜、番茄等幼苗［6-8］的伤害，提高植物的耐寒性。

铁皮石斛的研究多集中于组培［9-11］、栽培［12-14］、药用［15，16］等方面；目前涉及低温胁迫的文献相对较少［17，18］；对于添加硅、硒缓解铁皮石斛低温胁迫的报道更少，仅有张艳嫣等［19］认为适量浓度硒可使铁皮石斛幼苗的耐冷性增强。而硅和硒配合使用对低温胁迫下铁皮石斛的抗寒性是否有影响鲜见报道。本研究基于硅和硒可有效缓解植物低温伤害的理论知识，揭示硅和硒配合使用对低温胁迫下铁皮石斛幼苗的影响和低温伤害的缓解作用，探讨有效缓解铁皮石斛低温伤害的硅和硒复配剂的适宜浓度等关键技术难题，以期为提高铁皮石斛的产量和低温胁迫下幼苗成活率等问题提供理论指导，亦为铁皮石斛大范围推广应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

以出瓶栽培一年的铁皮石斛组培苗为供试材料，栽培于江苏农林职业技术学院农博园大棚内。

1.2 试验设计

试验采用盆栽方式，从温室栽培床上挖出生长均匀、无病虫害的盆栽铁皮石斛幼苗，移栽到装有铁皮石斛专用基质的塑料花盆中（规格为高18 cm、底面直径15 cm），每盆6株。置于大棚内正常培养15 d，在医用冷藏箱内2℃低温胁迫7 d后进行硅和硒复配剂处理。

硅和硒均设置了4个浓度梯度，分别为0、25、50、75 mg/L和0、5、7.5、10 mg/L，采用不完全随机设计将二者进行复配，共12种复配剂处理，具体的浓度见表1。各处理均是在1/2 Hoaglang营养液的基础上添加相应浓度的硅和硒，每个处理5次重复。硒用分析纯的亚硒酸钠（Na2SeO3），硅用分析纯的九水硅酸钠（Na2SiO3·9H2O）。复配剂以叶面喷洒的形式施入，喷施至叶片完全湿润为准，之后置于人工气候箱内培养20 d。人工气候箱设定25℃，光照度4 000 lx，12 h光培养/12 h暗培养。在培养过程中，定期观察植物生长状况并正常管理。复配剂处理至一定时间后采取倒3～5片叶片，置于-75℃低温冰箱中保存，用于生理指标的测定。

表1 硅和硒复配剂处理

1.3 测定项目

叶绿素含量的测定：参照《植物生理生化实验原理与技术》［20］中的叶绿体色素含量的测定方法进行。脯氨酸含量（Pro）的测定：利用脯氨酸分光光度计试剂盒法，试剂盒由苏州科铭生物技术有限公司（下同）提供。丙二醛含量（MDA）的测定：利用丙二醛分光光度计试剂盒法。超氧化物歧化酶（SOD）的测定：利用超氧化物歧化酶分光光度计试剂盒法。过氧化物酶（POD）的测定：利用过氧化物酶分光光度计试剂盒法。过氧化氢酶（CAT）的测定：利用过氧化氢酶分光光度计试剂盒法。

2 结果与分析

2.1 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛叶绿素含量的影响

叶绿素可以吸收、传递光能，其含量多少在一定程度上决定了植物对光的吸收和利用效率，常作为研究光合生理的重要指标［21］之一。植物体内叶绿素含量的增加可以在一定程度上提高其光合速率的转换，促进植物生长，进而间接提高抗逆性。从图1可以看出，不同浓度的硅和硒复配剂处理对低温胁迫下铁皮石斛叶绿素含量的影响不同。其中处理G6的叶绿素含量最高，其次是G8、G7、G9和G5，这5个处理间叶绿素含量差异不显著，但均显著高于对照（G1）；处理G10的叶绿素含量最低，其次是G1（对照）、G11、G12和G2，这5个处理间叶绿素含量差异不显著。低温胁迫下不同浓度的硅和硒复配剂对铁皮石斛叶绿素含量的影响为G10＜G1＜G11＜G12＜G2＜G3＜G4＜G5＜G9＜G7＜G8＜G6。复配剂G2和G3为单一使用硅和硒的处理，其叶绿素含量与对照（G1）相比差异不显著，均较低。据此可初步判断，低温胁迫下硅和硒配合使用可增加铁皮石斛叶绿素含量，且二者配合使用时适宜的浓度可使铁皮石斛叶绿素含量显著增加，复配剂的浓度过高或过低均不利于叶绿素含量的增加，本研究认为硅和硒复配处理G6、G7和G8可以提高低温胁迫下铁皮石斛的叶绿素含量，促进植物生长。

图1 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛叶绿素含量的影响

2.2 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛脯氨酸含量的影响

研究表明［22］，在低温胁迫下，植物通过体内Pro含量的显著增加来缓解植物受到的伤害，从而提高其抗寒性。由图2可知，不同浓度的硅和硒复配处理对低温胁迫下铁皮石斛脯氨酸含量的影响各不相同。其中处理G9的脯氨酸含量最高，其次是G8、G7，这3个处理间脯氨酸含量差异不显著，但显著高于对照（G1）；处理G11的脯氨酸含量最低，其次是G1、G2、G3、G10和G12，这6个处理间叶绿素含量差异不显著。低温胁迫下不同浓度的硅和硒复配剂对铁皮石斛脯氨酸含量的影响为G11＜G1＜G2＜G3＜G10＜G12＜G6＜G5＜G4＜G7＜G8＜G9。复配剂G2和G3为单一使用硅和硒的处理，其脯氨酸含量与对照（G1）相比差异不显著，均较低，显著低于G9和G8，由此可说明，低温胁迫下硅和硒应配合使用才可明显提高铁皮石斛脯氨酸含量。适宜浓度的硅和硒配合使用时才可显著提高铁皮石斛Pro的含量，本研究认为硅和硒复配处理G8和G9可以显著提高低温胁迫下铁皮石斛的Pro含量，提高其抗寒性。

图2 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛脯氨酸含量的影响

2.3 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛丙二醛含量的影响

植物器官在低温逆境下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是其产物之一，通常利用其作为脂质过氧化指标，反映细胞膜脂过氧化程度和植物对低温逆境条件反应的强弱，其含量高低与植物抗寒性强弱呈反比。

不同浓度的硅和硒复配剂处理对低温胁迫下铁皮石斛MDA含量的影响不同（图3）。其中处理G5的MDA含量最低，其次是G6、G4、G7、G8和G9，6个处理间差异不显著，同时，这6个处理与G2、G3和G10相比差异不显著；处理G11的MDA含量最高，其次是G12、G1、G10、G2和G3，6个处理间MDA含量差异不显著，均较高。低温胁迫下不同浓度的硅和硒复配剂对铁皮石斛MDA含量的影响为G5＜G6＜G4＜G7＜G8＜G9＜G3＜G2＜G10＜G1＜G12＜G11。复配剂G2和G3为单一使用硅和硒的处理，其MDA含量与对照（G1）相比差异不显著，均较高，因此可说明，低温胁迫下硅和硒应配合使用才可明显降低铁皮石斛MDA的含量。硅和硒配合使用可以在一定程度上降低铁皮石斛MDA含量，但复配剂只有在浓度适宜时才可显著提高铁皮石斛MDA的含量，本研究认为硅和硒复配剂处理G4、G5、G6、G7、G8和G9可以显著降低低温胁迫下铁皮石斛的MDA含量，从而提高其抗寒性。

图3 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛MDA含量的影响

2.4 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛抗氧化酶活性的影响

2.4.1 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛SOD活性的影响 氧阴离子自由基是生物氧化、电子传递过程中产生的，可参与物质代谢、诱发细胞的一些不良反应等。当植物遭遇低温胁迫时，细胞中的超氧阴离子自由基积累过多，从而氧化、破坏生物大分子，甚至导致细胞死亡，而SOD可清除超氧阴离子自由基，缓解植物受到不良的伤害。

由图4可以看出，不同浓度的硅和硒复配剂处理对低温胁迫下铁皮石斛SOD活性的影响有所不同。其中处理G7和G8的SOD活性最高，其次是G4、G9、G5和G6，6个处理SOD活性差异不显著，均较高，显著高于其余6个处理；处理G2的SOD活性最低，其次是G1、G10、G11、G3和G12，6个处理间SOD活性差异不显著。低温胁迫下不同浓度的硅和硒复配剂对铁皮石斛SOD活性的影响为G2＜G1＜G10＜G11＜G3＜G12＜G6＜G5＜G9＜G4＜G8＜G7。复配剂G2和G3为单一使用硅和硒的处理，其SOD活性与对照（G1）相比差异不显著，均较低，显著低于处理G7、G8、G4、G9、G5和G6，故认为，低温胁迫下硅和硒应配合使用才可显著增加铁皮石斛SOD活性，从而提高其抗寒性；本研究认为适宜浓度的硅和硒复配剂（处理G4、G5、G6、G7、G8和G9）可以显著提高铁皮石斛SOD活性，一定程度上清除或降低低温胁迫造成的超氧阴离子自由基的积累，从而有效缓解铁皮石斛受到的低温伤害。

图4 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛SOD活性的影响

2.4.2 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛POD活性的影响 研究表明，POD是植物体内抗氧化系统的组成部分，具有抵御组织细胞发生膜脂过氧化的作用，POD活性高低与抗寒性强弱密切相关［23］。由图5可以看出，不同浓度的硅和硒复配剂处理对低温胁迫下铁皮石斛POD活性的影响不同。其中处理G8和G7的POD活性最高，其次是G5、G6和G9，5个处理间POD活性差异不显著，前2个处理显著高于对照；处理G11的POD活性最低，其次是G10、G12、G2、G3和G1，6个处理间POD活性差异不显著，均较低。低温胁迫下不同浓度的硅和硒复配剂对铁皮石斛POD活性的影响为G11＜G10＜G12＜G2＜G3＜G1＜G4＜G9＜G6＜G5＜G7＜G8。

图5 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛POD活性的影响

复配剂G2和G3为单一使用硅和硒的处理，其POD活性与对照（G1）相比差异不显著，均较低，显著低于G7和G8，稍高于处理G10、G11和G12，据此可说明，单一使用硅和硒不能使低温胁迫下的铁皮石斛POD活性增加，硅和硒应配合使用才可明显增加铁皮石斛POD活性，POD活性的增强可提高铁皮石斛的抗寒能力，缓解低温胁迫的伤害；硅和硒复配剂可以在一定程度上提高铁皮石斛POD活性，但复配剂的浓度过高或过低均不利于POD活性稳定地增大，只有在浓度适宜时才可显著提高铁皮石斛POD活性，本研究认为硅和硒复配剂处理G7和G8可以显著提高低温胁迫下铁皮石斛的POD活性。

2.4.3 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛CAT活性的影响 CAT是植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶之一，在植物胁迫应答以及控制细胞的氧化还原平衡等方面起着重要的作用，其作用是催化H2O2分解为H2和O2［24］。

由图6可知，不同浓度的硅和硒复配处理对低温胁迫下铁皮石斛CAT活性的影响各不相同。其中处理G8的CAT活性最高，其次是G5、G7、G6、G4和G9，这6个处理间CAT活性差异不显著，均显著高于对照（G1）；处理G1的CAT活性最低，其次是G2、G3、G11、G10和G12，6个处理间CAT活性差异不显著，均较低。低温胁迫下不同浓度的硅和硒复配剂对铁皮石斛CAT活性的影响为G1＜G2＜G3＜G11＜G10＜G12＜G9＜G4＜G6＜G7＜G5＜G8。

图6 硅和硒复配对低温胁迫下铁皮石斛CAT活性的影响

复配剂G2和G3为单一使用硅和硒的处理，其CAT活性与对照（G1）相比差异不显著，均较低，显著低于G4、G5、G6、G7和G8，由此可判断，单一使用硅和硒可使低温胁迫下的铁皮石斛CAT活性增加，但效果不明显，低温胁迫下硅和硒应配合使用才可显著增加铁皮石斛的CAT活性。本研究认为适宜浓度的硅和硒复配剂（处理G4、G5、G6、G7和G8）可显著提高铁皮石斛CAT的活性，提高抗寒性。

3 小结与讨论

本研究表明，单一使用硅和硒可在一定程度上提高低温胁迫下铁皮石斛的抗寒性，但效果不明显，硅和硒应配合使用才可以显著减缓铁皮石斛的低温伤害，具体表现为叶绿素含量和脯氨酸含量的增加，POD、SOD和CAT增强，MDA活性下降。

叶绿素是植物进行光合作用时捕获光能的重要物质，其含量的高低在某种程度上与植物的生长密切相关。硅和硒复配的浓度应适宜，过高或过低均不利于铁皮石斛叶绿素含量的增加，本研究认为硅和硒复配剂浓度为25 mg/L硅+10 mg/L硒、50 mg/L硅+5 mg/L硒、50 mg/L硅+7.5 mg/L硒时可显著减缓低温胁迫下铁皮石斛叶绿素含量的下降，促进植物生长。朱佳等［25］研究了不同硅处理对低温胁迫条件下小麦幼苗光合作用、叶绿素和可溶性糖含量的影响，表明一定量浓度的Si有助于保护低温胁迫下小麦叶绿体膜，保持其结构的稳定性，从而提高叶绿素合成速率，使小麦维持较高的叶绿素含量。张艳嫣等［19］认为，硒处理对低温胁迫下铁皮石斛幼苗叶绿素降解具有缓解效应。故硅和硒均具有在低温胁迫下控制铁皮石斛体内叶绿素含量下降的作用，本研究得出了相似的结果。硅和硒复配剂浓度为50 mg/L硅+5 mg/L硒、50 mg/L硅+7.5 mg/L硒、50 mg/L硅+10 mg/L硒可以显著提高低温胁迫下铁皮石斛的Pro含量、显著降低MDA含量。Pro可稳定细胞含水量，维持细胞膜结构，通过防止细胞膜脂质过氧化来降低低温胁迫对铁皮石斛造成的伤害［17］，Pro含量的增加可有效提高铁皮石斛的抗寒性。MDA在铁皮石斛植物体内含量的降低可减弱膜系统受损程度，进而提高铁皮石斛的抗寒性［17］。吴燕等［3］研究认为，外施硅可以使低温胁迫的乌塌菜叶片迅速积累大量的脯氨酸，从而有效缓解低温胁迫对乌塌菜幼苗的影响。张艳嫣［26］喷施硒溶液显著提高了低温胁迫下铁皮石斛体内脯氨酸含量，MDA含量平缓降低，在一定程度上提高了植物对低温胁迫的抵抗与适应能力。以上研究证明，硅和硒可以使低温胁迫条件下植物体内的MDA含量降低、Pro含量升高，与本研究结果相一致，但这些研究均是单一使用硅和硒。本研究发现，适宜浓度的硅和硒配合使用，在提高铁皮石斛抗寒性方面比单一使用硅和硒效果更佳。

POD、SOD和CAT是植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶，三者相互协调配合清除H2O2，使体内自由基维持在正常的动态水平，减少膜脂过氧化反应，减轻细胞膜的损伤，其活性的强弱直接关系着植物抵御低温伤害的能力［27］。张彩虹等［28］和孙丽［6］分别研究了硒对低温胁迫下番茄和草莓幼苗抗氧化系统的影响，发现喷施Se有效增加了低温胁迫下植物叶片中的SOD、POD和CAT活性，有效清除了低温伤害产生的H2O2。研究表明［2-5］，使用一定浓度的硅提高了低温胁迫下的小麦、乌塌菜、黄瓜、水稻等抗氧化酶活性。本研究将硅和硒配合使用，认为喷施25 mg/L硅+10 mg/L硒、50 mg/L硅+5 mg/L硒、50 mg/L硅+7.5 mg/L硒的硅和硒复配剂时可以使低温胁迫下铁皮石斛的抗氧化酶活性显著增加，从而提高了低温胁迫下铁皮石斛清除自由基、保护细胞膜、抵御低温伤害的能力。

综合考虑6个生理指标，低温胁迫下叶面喷施浓度为50 mg/L硅+5 mg/L硒、50 mg/L硅+7.5 mg/L硒的硅和硒复配剂时，铁皮石斛叶绿素含量、Pro含量、POD、SOD和CAT活性均显著增加，MDA含量显著下降，可显著提高铁皮石斛抗寒性，降低低温胁迫造成的伤害。