表达大熊猫源犬瘟热病毒H蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定

陈廷炜 孟宪踊 王铁成 高玉伟 冯 娜* 夏咸柱*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春，130118；2.军事医学研究院，军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春，130122)

犬瘟热(canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性和高致死性的病毒性传染病。近年来，CDV感染的宿主范围逐渐扩大，包括犬科(Canidae)、猫科(Felidae)、鬛狗科(Hyaenidae)、鼬科(Mustelidae)、浣熊科(Procyonidae)、灵猫科(Viverridae)、熊猫科(Ailuridae)及非人灵长类(Non-human primates，NHPs)等动物。1997—2015年累计7只圈养大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)感染CDV死亡，提示CD已成为威胁大熊猫生命安全的第一大传染病[1]。经过科研人员的不懈努力，全球大熊猫圈养种群数量已超过600只，可持续圈养种群基本形成。为了降低大熊猫感染CD的风险，对CD疫苗免疫的需求显得尤为迫切。

CDV属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，麻疹病毒属(Morbillivirus)，是负链单股不分节段的RNA病毒。CDV基因组的长度为15 690 bp，基因组从3′端到5′端共编码6种蛋白：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)、大蛋白(L)[2-3]。其中CDV H蛋白基因长度为1 944—1 946 bp，只有1个开放阅读框，相对分子质量为76 000—85 000。H蛋白位于病毒粒子表面，属于Ⅱ型糖蛋白，其上分布有许多抗原表位，是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白，发挥着体液免疫反应主要诱导剂的功能[4]。此外，H蛋白还包含细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，可产生特异的CTL活性，通常用作基因工程疫苗的靶标基因，以预防CD[5]。

腺病毒载体是最为常用的疫苗开发和基因治疗的病毒载体[6]，近几年发展很快，已经在全球数百个临床试验中进行了测试，证明该病毒载体具有良好的安全性，宿主的范围广泛，产生重组病毒滴度较高[7]，外源蛋白表达量高，并且还具有高免疫原性[8-10]。本研究选择缺失了编码腺病毒早期蛋白的E1区和E3区的复制缺陷型人5型腺病毒作为大熊猫源犬瘟热病毒H蛋白的呈递表达系统，获得的能够表达giant panda/SX/2014 H蛋白的重组腺病毒rAd-CDV-H可以为大熊猫犬瘟热预防免疫以及同其他载体联合免疫提供候选疫苗株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病毒、细胞和菌株

大熊猫源犬瘟热病毒giant panda/SX/2014(GenBank：KP793921)，由军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所分离与保存；293A细胞购自汉恒生物公司；基因工程菌EscherichiacoliDH5α购自TaKaRa公司。

1.1.2 主要试剂

病毒RNA提取试剂盒购自天根公司，TransStart FastPfu DNA Polymerase购自全式金公司，质粒提取试剂盒购自康为世纪公司，pAd/CMV/V5-DEST腺病毒载体、pENTR/D-TOPO入门载体、Gateway LR ClonaseII Enzyme Mix、Anti-V5抗体、Lipofectamine®2000转染试剂均购自Invitrogen公司，PacⅠ限制性内切酶、SuperSignal®West Dura持久性化学发光底物购自Thermo Scientific公司，Adeno-X Rapid Titer Kit、Reverse Transcriptase XL(AMV)购自TaKaRa公司，Goat anti-Mouse IgG(H+L)-HRP购自Bioword公司，山羊多克隆抗体购自VMRD公司，Rabbit Anti-Goat IgG(whole molecule)-FITC，购自SIGMA公司。

1.2 试验方法

1.2.1 测序引物及基因扩增

根据大熊猫源犬瘟热病毒giant panda/SX/2014H基因序列，使用Primer premier 5.0软件分别设计上下游引物，引物序列CDVHF为，5′-CACCGCCACCATGCTCTCTTACCAAGA CAAGGT-3′；CDVHR为，5′-AGGTTTTGAACGGTT ACATGAGAAT-3′(ATG前引入增强H基因表达的Kozak序列(下划线))；pAd/CMV/V5-DEST腺病毒载体测序引物T7为，5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；V5(C-term)为，5′-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3′，以上引物由长春库美公司合成。

使用病毒基因组RNA提取试剂盒提取大熊猫源犬瘟热病毒giant panda/SX/2014基因组RNA，反转录后利用CDVHF/CDVHR进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性2 min；95℃变性20 s，52℃退火 20 s，72℃延伸90 s，共35个循环；72℃再延伸5 min。PCR产物经质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳后观察是否正确后回收。

1.2.2 重组腺病毒的构建

将1.2.1中胶回收得到的目的片段通过TOPO克隆连接至入门载体pENTR/D-TOPO中，获得重组入门质粒pENTR/D-TOPO-CDV-H，分装后送至长春库美公司测序。使用Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix将测序正确的重组入门质粒与腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST进行LR重组得到重组腺病毒质粒pAd-CDV-H，质粒经PCR鉴定阳性后送至测序公司进行测序验证。

1.2.3 重组腺病毒的包装

测序验证正确的重组腺病毒质粒pAd-CDV-H经PacⅠ酶切处理线性化后按Lipofectamine®2000说明书转染至293A细胞，37℃，体积分数5%的CO2培养箱培养8 d，细胞出现明显的呈葡萄串状病变但未全部脱落时，反复冻融3次收获培养物，6 000 r/min，4℃离心5 min收集上清液，即为重组腺病毒第1代，命名为rAd-CDV-H，病毒液置于-80℃保存。连续传代后鉴定是否将外源基因重组到腺病毒载体中。

1.2.4 重组腺病毒滴度的测定

按照Adeno-X Rapid Titer Kit试剂盒说明书对保存的第7代重组腺病毒rAd-CDV-H进行测定。具体步骤为：将10倍连续稀释的病毒液50 μL/孔加入24孔细胞培养板的293A细胞中，每个稀释度至少2个重复，设正常细胞对照，37℃，体积分数5%的CO2培养箱中培养48 h。吸弃培养液，100%冷甲醇-20℃固定细胞10 min。弃液后用含质量分数1%BSA的PBS溶液清洗3次。之后孵育Anti-Hexon Antibody(1%BSA，1∶1 000稀释)，250 μL/孔，37℃孵育1 h；清洗3次后孵育Rabbit Anti-Mouse Antibody(HRP conjugate)(1%BSA，1∶500稀释)，250 μL/孔，37℃孵育1 h。弃液清洗3次后加入DAB工作液，500 μL/孔，室温孵育10 min。弃液后加入PBS，500 μL/孔，计数20倍显微镜至少3个视野中棕色阳性信号数量(以每个视野包含5—50个棕色阳性信号数量为宜)，以其平均数根据公式，计算病毒滴度。

病毒滴度(IFU/mL)=[(感染细胞/视野)×(视野/孔)]/[病毒液体积(mL)×稀释系数]

1.2.5 间接免疫荧光方法鉴定

先在24孔细胞培养板中分别接种293A细胞和Vero细胞，当细胞汇合度达70%左右时，接种重组腺病毒rAd-CDV-H，接毒量为100 MOI(multiplicity of infection，感染复数)，然后放入37℃，体积分数5%CO2的培养箱中培养48 h。吸弃培养液，用体积分数80%的冷丙酮室温固定细胞30 min。弃液后使用PBST溶液清洗3次。孵育山羊抗犬瘟热病毒多克隆抗体(1%BSA，1∶400稀释)，250 μL/孔，37℃孵育1 h，之后孵育加入伊文思蓝溶液的Rabbit Anti-Goat IgG(whole molecule)-FITC(1%BSA，1∶200稀释)，250 μL/孔，避光盒内37℃孵育 1 h。经PBST溶液洗涤3次后置于荧光显微镜下观察。

1.2.6 Western blot鉴定

在6孔细胞培养板中接种293A细胞，细胞生长至70%汇合度时，接种重组腺病毒rAd-CDV-H，接毒量为100 MOI，当细胞发生病变且未完全脱离底部时，弃去细胞培养液，用RIPA细胞裂解液冰上裂解细胞后收集到1.5 mL离心管中，与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合，沸水煮样10 min后，进行SDS-PAGE电泳并将蛋白利用湿转转印至NC膜，经封闭液封闭后，以Anti-V5抗体为一抗，4℃过夜孵育后，使用Goat anti-Mouse IgG(H+L)-HRP为二抗，室温孵育，最后在曝光仪中鉴定重组腺病毒H蛋白的表达情况。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的鉴定

利用CDVHF/CDVHR引物对重组腺病毒质粒pAd-CDV-H进行PCR扩增，电泳显示可扩增出大小约为1 821 bp的片段(图1)，证明目的片段已成功插入到重组质粒中，然后将重组质粒分装后与T7/V5(C-term)引物送至测序公司进行测序验证，结果表明插入的H基因序列与大熊猫源犬瘟热病毒H基因序列一致。

2.2 重组腺病毒的酶切鉴定

重组质粒pAd-CDV-H经PacⅠ酶切后电泳结果显示2个特异片段，大小分别为约36 kb线性化重组质粒pAd-CDV-H和2 028 bp的PacⅠ酶切条带，结果正确(图2)。

2.3 重组腺病毒的包装

用Lipofectamine®2000转染试剂介导线性化的重组质粒pAd-CDV-H转染293A细胞，转染后8 d，转染孔293A细胞圆缩、聚堆明显，呈典型的葡萄串状细胞病变(图3A)，细胞对照形态正常(图3B)。

2.4 重组腺病毒的滴度测定

DAB显色后第7代重组腺病毒rAd-CDV-H选择10-5稀释度的细胞孔的阳性信号数量最佳(1个视野内有5—50个棕色信号)，计算重组腺病毒的滴度(图4A)；阴性对照细胞孔无深棕色信号(图4B)。根据1.2.4公式计算，病毒滴度=(21×313)/(0.05×10-5)=1.31×1010IFU/mL。

2.5 重组腺病毒H蛋白表达鉴定

2.5.1 间接免疫荧光检测

以山羊抗犬瘟热病毒多克隆抗体作为一抗，Rabbit Anti-Goat IgG(whole molecule)-FITC作为二抗进行间接免疫荧光染色。倒置荧光显微镜下观察结果显示，接种重组腺病毒的293A细胞和Vero细胞均能观察到特异的绿色荧光信号(图5A，图5C)，而对照组的293A细胞和Vero细胞无绿色荧光信号(图5B，图5D)。结果表明，重组腺病毒rAd-CDV-H能够稳定介导H蛋白在293A细胞及非包装复制细胞中有效表达。

2.5.2 Western blot 鉴定

用Anti-V5抗体作为一抗，Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP作为二抗，经Western blot检测，在约81 kd位置可见1条特异性的曝光条带(图6)，而未感染细胞无特异性蛋白条带，进一步证明CDV H蛋白在重组腺病毒rAd-CDV-H感染293A细胞中得到有效表达。

3 讨论

犬瘟热病毒(CDV)对大熊猫的致死性感染迄今已发生过2次，分别为1997年重庆市及2014年末至2015年4月陕西省累计7只大熊猫感染CDV死亡。鉴于感染CDV的大熊猫死亡造成的严重影响，迫切需要疫苗接种来保护大熊猫种群。目前，我国依赖进口CD疫苗进行圈养野生动物的接种，且无稳定有效的大熊猫专用CD疫苗[11]。此外市售CD疫苗中的毒株均为弱毒疫苗株。据报道，这种CD疫苗可能会引起犬只的感染与发病，特别是一些易受感染的野生动物，对大熊猫来说并不安全[12]。因此，急需探索研制新型安全、高效的大熊猫CD专用疫苗。

腺病毒作为一种病毒载体已普遍用于基因疫苗等领域，且优点多：首先宿主的范围很广泛；其次是基因组背景信息清晰，易于构建及包装，插入的外源基因可以为大片段的[13]；另外，重组病毒滴度高；表达的产物可以刺激机体产生体液免疫、细胞免疫[14-15]和黏膜免疫[16-17]反应等；还可同其他载体进行联合免疫[18]；腺病毒载体疫苗还有一大优点是可制成不同的剂型延长保存期，如口服[19]、冻干粉等剂型，无需佐剂[20]。大熊猫作为珍稀野生动物，CD免疫的候选疫苗研制应优先思量其安全性。本研究选用了缺失人5型腺病毒复制必须的E1基因的复制缺陷型腺病毒载体，使拯救后所得重组病毒无法在机体内进行复制增殖，大大提高了弱毒疫苗的安全性。

CDV的囊膜是由1个膜蛋白M和2个表面糖蛋白H(血凝素)和F(融合)蛋白组成。其中H蛋白是CDV及其动物宿主的关键蛋白。H蛋白介导CDV病毒粒子与宿主细胞表面受体结合诱发感染，所以针对H蛋白研究是宿主预防CDV感染的关键。Ge等[21]构建了表达血凝素(H)或融合蛋白(F)的重组新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)：rLa-CDVH和rLa-CDVF，并选用对CDV易感的动物水貂(Neovisonvison)进行免疫评估，结果显示rLa-CDVH诱导了针对CDV显著的中和抗体(NA)，并对CDV强毒攻击提供了有力保护；相反，rLa-CDVF诱导CDV的NA很低，无法抵抗CDV强毒的攻击。Wang等[22]利用反向遗传学技术制备1种新的基于狂犬病毒(RV)的疫苗载体，该疫苗载体表达了CDVH基因，即重组病毒LBNSE-CDV-H。试验选用犬来进行LBNSE-CDV-H的免疫评估，结果显示接种重组病毒LBNSE-CDV-H的犬无任何疾病现象，且可以抵御致命野生型CDV毒株的攻击。袁颖烁等[23]使用E1和E3基因缺失的商品化RAPAd®CMV腺病毒表达载体构建表达了含有CDVH基因的人5型重组腺病毒疫苗，对犬一次免疫后，在体内产生CDV的NA滴度最高达28，强于弱毒疫苗组。上述研究表明，H蛋白产生的免疫应答抗CDV攻击的能力很好。

本研究利用腺病毒作为基因工程表达载体的优势，成功构建了表达大熊猫源CDVH基因的重组腺病毒，有望提供一种安全且有较好免疫原性的疫苗候选株。研究采用的是Invitrogen公司的腺病毒表达系统联合Gateway技术，获得了重组腺病毒rAd-CDV-H，相较于传统的同源重组法和常用的AdEasy包装系统，研究采用的腺病毒表达系统构建更便捷且高效。构建的复制缺陷型人5型重组腺病毒的滴度为1010IFU/mL，通过免疫荧光方法和Western blot鉴定结果证明，rAd-CDV-H 感染293A细胞后成功表达H蛋白；另外，将rAd-CDV-H接种Vero细胞后，通过IFA鉴定了其在不能复制的情况下也可以有效地表达H蛋白，为其应用于多种宿主的免疫提供数据支撑。

4 结论

本研究成功构建了携带大熊猫源CDV分离株giant panda/SX/2014H基因的复制缺陷型人5型重组腺病毒rAd-CDV-H，并证实了重组腺病毒rAd-CDV-H能够在体外有效表达CDV H蛋白。考虑到国宝大熊猫这一物种的特殊性和重要性，考虑可先通过小鼠、兔与狗等动物实验评估其安全性和免疫原性，进一步证明该疫苗的有效性与安全性后，再向国家主管部门申报开展免疫大熊猫的临床试验，若证明其安全有效，则可将其纳入免疫大熊猫的候选疫苗株。