阿尔茨海默病病人血液、尿液的代谢组学研究

崔宇 王晓坤 张燕 孙宏

AD是现阶段世界范围内尚无确切治疗方案的一种神经退行性疾病[1]。AD前期多不易被发现,或以轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment,MCI)被临床所发现,由于早期缺乏特异性诊断方法,导致其生存率较低[2]。

代谢组学是近些年才快速开展起来的组学研究,可通过研究早期潜在的代谢标志物为生物系统提供完整、准确、动态的代谢网络图，并进一步揭示生物体新陈代谢过程中代谢产物的动态变化规律，有助于全面理解疾病的变化过程和阐释发病机制及体内物质代谢途径等[3]。本研究旨在探讨AD病人血液和尿液的代谢组学变化。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究对黑龙江省农垦地区9个管理局的66家福利院共1862名≥65岁且未患过脑血管疾病的老年人进行的流行病学调查。根据有无AD将研究对象分为AD组和对照组。

AD组的纳入标准：年龄≥65岁；按照美国精神医学会的《精神障碍诊断和统计手册》第4版(DSM-Ⅳ)标准诊断痴呆，采用美国国立神经病语言障碍卒中研究所和阿尔茨海默病及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)标准诊断AD。

对照组的纳入标准：年龄≥65岁；现场调查者访问和体检过程中未发现认知功能衰退或损害的征象，MMSE测试成绩均在正常范围内。从已确定的AD组和对照组中随机筛选出34例AD病人和31例健康老年人进行检测。本研究遵照《赫尔辛基宣言》的原则实施,研究对象均已知情同意。

1.2 实验仪器与试剂 氨基酸自动分析仪(L-8800，日本日立公司)；Quattro micro液相色谱-质谱联用仪， 混合氨基酸标准品(美国，Sigma公司)；甲酸(色谱纯，北京Dikma公司)；乙腈(色谱纯，北京Dikma公司)；甲醇(色谱纯，北京Dikma公司)等。

1.3 实验方法

1.3.1 血液及尿液的采集：采集血样前3 d，给予受试对象相同饮食，加强样本基础质控。于第4天清晨7:00～9:00时取空腹静脉血5 mL，3000 r/min离心10 min，取上层血清，置于EP管中，-80 ℃低温冰箱保存。

采集晨中段尿20 mL,收集于50 mL洁净塑料管中， 3000 r/min室温离心10 min,精确吸取4.0 mL尿样上清液，置入5.0 mL洁净的离心管中， 12 000 r/min，4 ℃，离心10 min；精确吸取2.0 mL分别置于1.5 mL洁净的EP管中，每管1 mL,于-80 ℃冰箱中冻存备用。

1.3.2 血清及尿液氨基酸分析 将血清及尿液样品室温条件下解冻。取0.5 mL血清、1.0 mL尿样分别置于5.0 mL容量瓶中，分别加10%磺基水杨酸除蛋白，定容，混匀；用10 mol/L氢氧化钠分别调pH至2.2；离心,取上清液分别置于EP管中，备检。取上清液1.5 mL，过0.45μm水性微孔滤膜到上机进样瓶中，L-8800氨基酸分析仪分别检测尿液和血清中17种游离氨基酸含量。

1.3.3 尿样超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用技术分析

1.3.3.1 样品前处理及检测:将尿液样品室温下解冻。12 000 r/min转速于4 ℃下，离心10 min，取上清300μL，加入300μL双蒸水稀释，涡旋混匀，转入自动进样瓶中，进样检测，进样量为2μL。

1.3.3.2 高效液相色谱串联质谱数据分析:原始数据通过Waters Micromass Markerlynx Application Version 4.0完成采集，Markerlynx用来进行峰选择和峰调整。数据经Markerlynx导入EXCEL，形成三维数据矩阵，在SMICA-P 11.0操作模式下，建立工程，实现多变量主成分分析(PCA)。

1.3.3.3 生物标志物的确定及结构解析:根据PCA初步确定出可能的生物标志物，根据二级质谱中的分子质量检索Metlin确定出未知代谢物的结构和分子式。查阅相关数据库，得到相应化合物的mol文件。利用Masslynx软件将文件导入相应的二级质谱图中，选择相应的正、负离子模式，进行massfragment匹配分析，筛选出最有可能的一种或几种化合物。

2 结果

2.1 尿液中游离氨基酸水平 2组受试对象的尿液中均检出了15种氨基酸：天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸；另外异亮氨酸和脯氨酸未检出。另外，2组尿液中苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸和赖氨酸的水平差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 血液中游离氨基酸水平 2组受试对象的血清中，17种氨基酸均得到检出。另外，2组血清中苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组尿液和血液中游离氨基酸含量比较

2.3 尿液中生物标志物的筛选和确定 根据多变量偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)筛选AD组病人尿液中的生物标志物。在正、负离子化模式下，参照Scripps、ChemSpider和HMDB数据库，推断15种化合物可能的结构依次为N-丙烯酰基-甘氨酸、精氨基琥珀酸、脱硫生物素、L-乙酰肉碱、异丁酰基-L-肉碱、C16二氢神经鞘氨醇、壬二酸、雌二醇-1,3,5,(10),7-4-3,17α-二醇、L-天门冬氨酰-4-磷酸盐、L-谷氨酰胺、对甲酚-葡糖苷酸、本胆烷醇酮-葡糖苷酸、5-L-谷酰基甘氨酸、氨蝶呤、胞嘧啶核苷。上述物质在对照组中均未检出。

3 讨论

3.1 游离氨基酸代谢水平对AD机体的影响 氨基酸参与机体内多种活性物质的合成和代谢，在机体的学习记忆、神经传导、免疫功能和受体功能等方面发挥着重要作用[5]。氨基酸的检测对于某些疾病的筛查、诊断和治疗具有重要意义[6]。氨基酸是脑内重要的神经递质，大脑区域特定部位的一些氨基酸含量与学习记忆能力有关，对学习记忆和突触形成至关重要。天门冬氨酸和谷氨酸等兴奋性氨基酸对神经元有兴奋作用，大量释放可损伤神经细胞，导致学习记忆障碍[7]。本研究AD组尿液中天门冬氨酸和谷氨酸排泄量减少，提示它们在AD病人体内可能发生了代谢紊乱，过度的转运和传导，可刺激损伤神经元，造成记忆损害。苏氨酸、缬氨酸和赖氨酸是人体必需氨基酸，能够增强机体免疫，改善记忆力，提高中枢神经系统功能。丝氨酸是人体非必需氨基酸，在体内合成，可维护脑与心脏的功能。这些氨基酸在体内共同作用，经三羧酸循环作用于磷酸化合物，能够促使脑细胞活性增强，恢复衰竭的神经元，改善中枢神经系统功能[8]。AD组血液中蛋氨酸的含量明显低于对照组。机体内蛋氨酸在蛋氨酸腺苷转移酶的催化作用下，与ATP反应，可生成Hcy。Hcy可以造成神经系统损伤。研究证实,Hcy是AD发生发展过程中一个重要的危险因素[9]。此外，Hcy可以经过转硫途径回转生成半胱氨酸，本研究结果显示AD组血清中半胱氨酸显著高于对照组，这可能是机体内Hcy的浓度过高，其中一部分通过转硫作用生成了半胱氨酸，导致血清中半胱氨酸的浓度异常升高。

AD病人血清中亮氨酸含量显著低于对照组。最新研究发现，中枢神经系统的营养感应信号通路与外周组织的代谢分子调控网络关系密切，其功能紊乱是促发代谢性疾病的重要原因，亮氨酸缺乏能够激活下丘脑神经元的信号通路，下丘脑具有神经系统的功能，通过营养感应信号通路进而激活对外周组织的代谢调控。这可能是AD病人机体内氨基酸水平代谢紊乱的一个重要原因。

3.2 AD病人尿液中代谢物分析 N-丙烯酰基-甘氨酸是酰基甘氨酸的一种。研究发现，在一些先天性代谢紊乱症病人中，某些特定的酰基甘氨酸排泄量相应增多[10]，本研究结果显示，AD组中N-丙烯酰基-甘氨酸强度高于AD组，而AD组尿液中甘氨酸含量高于对照组。结合N-丙烯酰基-甘氨酸的形成过程，分析可得，AD组可能由于机体内代谢途径发生紊乱，一方面，导致甘氨酸随尿液排出体外的量增加，另一方面，导致体内甘氨酸和酰基辅酶A发生过度的代偿反应，生成大量的N-丙烯酰基-甘氨酸。作为抑制性氨基酸，甘氨酸和其代谢物N-丙烯酰基-甘氨酸，在机体内代谢紊乱，致使其保护神经元不被损害的能力下降。

精氨基琥珀酸是鸟氨酸循环与瓜氨酸-一氧化氮循环的中间产物，在精氨基琥珀酸合成酶的作用下，由瓜氨酸与天门冬氨酸羧合而成，可进一步释放出延胡索酸而生成精氨酸[11]。当机体发生代谢紊乱时，天门冬氨酸大量蓄积在体内，造成精氨基琥珀酸的合成增加，进而导致精氨酸在体内的增加，作为兴奋性氨基酸，天门冬氨酸的过度转运和传导，可损伤神经细胞，导致学习记忆障碍。

L-乙酰肉碱(LAC)和异丁酰基-L-肉碱(ILC)同属于醋酸酯类物质中的一种。除了在代谢活动中发挥的作用，LAC还具有神经保护、神经调节和神经营养的特性，这些对神经系统的保护功能使得其在阻止神经退行性疾病的进展过程中发挥了十分重要的作用。

L-天门冬氨酰-4-磷酸盐，在机体内参与赖氨酸和高丝氨酸的生物合成。而赖氨酸具有提高并维护中枢神经系统功能的作用，因此，认为L-天门冬氨酰-4-磷酸盐与AD的发生发展有关，可以作为AD的标志物之一。

L-谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，属于人类机体内的一种非必需氨基酸，在体内可由葡萄糖转变而来，也可由谷氨酸、缬氨酸及异亮氨酸合成。有研究者认为，谷氨酰胺酰基环化酶与AD的发生关系密切，有望成为治疗AD的新靶点[12]。也有学者认为，血清中谷氨酰胺合成酶在作为诊断AD的生物标志物方面并没有价值[13]。

5-L-谷酰基甘氨酸是一种兴奋性氨基酸受体拮抗剂，与γ-氨基丁酸(GABA)的结构相似，GABA是一种抑制性氨基酸，可以减少谷氨酸的释放，拮抗谷氨酸的毒性，能够保护神经元处于抑制状态，进而减少神经细胞的死亡。研究证明，抑制性氨基酸含量的降低，可造成AD病人学习记忆障碍[14]。

胞嘧啶核苷是构成核酸的嘧啶核苷之一。有研究报道，胆碱和胞嘧啶核苷是细胞膜的主要前体物，并且是细胞膜形成的主要调控元件，这2种物质联合应用能够升高机体磷脂水平、增加PC12细胞的表达和分泌，而β淀粉样前体蛋白(APP)是细胞膜脂质双分子层的主要跨膜蛋白，所以该研究认为这种刺激细胞膜生物合成的情况也可以用于刺激AD等神经退行性疾病中APP的分泌和神经突触的形成[15]。

综上所述，AD病人体内发生了氨基酸代谢紊乱或障碍，并发现了AD病人尿液中可能的生物标志物，这些结果对AD发病机制和临床诊疗方面的研究提供了一个新的方向。