葡萄灰霉病病原菌鉴定及天然药物的抑制效果评价

张威，周勇,2,3*，彭言劼,2,3，刘忠,2,3，郑英

（1. 乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614000；2. 乐山师范学院峨眉山研究院，四川乐山 614000；3. 峨眉山生物多样性保护与利用研究所，四川乐山 614000；4. 乐山市农业科学研究院，四川乐山 614000）

葡萄是世界四大水果之一，在我国具有悠久的种植历史，且总产量位于世界首位[1]。我国南方地区日照充足，雨量充沛，在鲜食葡萄生产中具有显著的地域优势。四川盆地作为南方葡萄的主要产区，在鲜食葡萄生产中发挥着重要作用。但四川盆地高温高湿的气候环境易诱发葡萄病虫害的发生[2]，其中灰霉病是威胁葡萄生产的主要病害之一[3]。葡萄灰霉病病原菌为葡萄孢属真菌，其侵染植株后，引起植株体细胞程序性死亡，从而破坏组织正常生长，属于植物致病的死体营养型病原真菌类型[4]。早期报道的葡萄孢属真菌只有Botrytis cinereaPers，近年来又陆续发现能侵染葡萄的致病新种Botrytissp.2[5]、Botrytis pseudocinerea[6]、Botrytis sinoviticola[7]和Botrytissp. B83[8]。这些葡萄孢属新种在形态学上存在一定差异，并且对不同葡萄品种的致病力分化严重，感病品种发病常会造成大幅减产甚至绝产。

生产上对葡萄灰霉病的防治大多采用化学药剂方法[9]，易造成农残超标和环境污染，且化学药剂的作用机理单一，防治效果不理想等。据报道，目前已发现灰霉病病原菌对多菌灵、甲基托布津、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺等杀菌剂产生了不同程度的抗性，且部分能稳定遗传，甚至出现了多重抗药性或防效接近丧失的情况[10-16]。因此，研发高效、广谱、抗性持久、环境友好的杀菌剂是葡萄灰霉病防治中亟须解决的重要问题[17]。近年来，生物源农药因其环境友好、杀菌谱广、不易产生抗性等特点被广泛应用于植物病虫害防治。其中，植物源农药在病害防控方面的优势正日益受到人们的广泛重视。目前已发现药用植物飞廉、石菖蒲、冬凌草、黄连、黄芩等[18-21]的提取物和红蓼挥发油[22]可有效防治黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、苹果青霉病、魔芋软腐病、马铃薯环腐病等多种植物病害，但在利用植物源制剂对葡萄灰霉病防治方面鲜见报道。

本研究对四川成都葡萄产区田间灰霉病病原菌进行分离和鉴定，并探究了该病原菌对11个葡萄品种的致病力，同时利用药用植物提取液对葡萄灰霉病病原菌进行抑菌研究，旨在为该区域葡萄品种的产业布局、病害防治和天然药物开发等提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

葡萄灰霉病病原菌采自四川成都葡萄产区（双流）灰霉病染病葡萄植株。用于灰霉病病原菌致病力鉴定的11个葡萄品种为‘巨峰’‘夏黑’‘巨玫瑰’‘阳光玫瑰’‘维多利亚’‘黑巴拉多’‘美人指’‘寒香蜜’‘醉金香’‘紫甜’‘SO4’，采自四川省乐山市夹江县葡萄产区。

供试药材防己、苦地丁、金银花、海金沙、藿香、钩藤、黄连、黄苓、丁香、细辛、柴胡、荆芥、肉桂、小茴香、苍术、艾叶、辛夷、石榴皮、蛇床子、厚朴、千里香、金樱子、石菖蒲、大黄、苦参、青蒿，共26种，采购于乐山德盛堂大药房和文泽轩中药材店。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离及形态学观察

采集四川成都双流葡萄产区内6个种植基地表现典型灰霉病症状的葡萄果穗，用无菌保鲜袋密封后带回实验室。灰霉病病原菌的分离、纯化、培养参考方中达[23]的方法；再将病原菌菌株沿菌落边缘打取菌饼（直径5 mm）倒置转接于PDA培养基，黑暗恒温20 ℃培养，逐日观察记录分生孢子梗、分生孢子、菌核的形态特征。

1.2.2 葡萄灰霉病病原菌致病力检测

病原菌致病性检测参考离体叶片接种法[24]。2021年4月，采取供试品种当年生枝条上第3～5片成龄叶片，每品种选取3片叶，用无菌水清洗3次后擦干，置于铺有湿润滤纸的150 mm培养皿中，用针刺法在叶片中间接种部位制造3处伤口（避开叶片的主脉刺伤），取培养3 d的菌饼（直径5 mm）接种于离体叶片正面的伤口部位，以接种空白琼脂块为对照，每个叶片接种3处，同时设3个生物学重复。置于条件为20 ℃、100%相对湿度、16 h光照、8 h暗光的培养箱内培养。在接种后第3天和第6天统计发病情况，用十字交叉法测量病斑直径。并对发病叶片再次进行病原菌分离培养，观察菌落形态。

1.2.3 病原菌的SCAR标记检测

病原菌采用T5 Direct PCR Kit (Plus)（北京擎科）进行直接扩增，SCAR标记检测参考范璇[25]的方法，特异性引物（北京擎科）序列如表1所示。PCR扩增体系50 μL：包含DNA模板2 μL，2×T5 Direct PCR Mix(Plus)；上下游引物各2 μL（10 μmol/L）；最后用ddH2O补充至50 μL。PCR扩增程序：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，56.7 ℃/59 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共37个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，TS-GelRed核酸染料（北京擎科）进行染色，凝胶成像。

表1 葡萄灰霉病病原菌分子鉴定所用SCAR引物Table 1 SCAR primers for molecular identification of pathogen of grey mold in grapes

1.2.4 中草药提取液的制备

将26种中草药分别磨碎，各称取10 g，用80%乙醇50 mL浸泡，35 ℃、150 r/min恒温振荡提取48 h后，室温下4000 r/min离心6 min，提取母液，于5 ℃暗处储存备用。最终中草药浸提液的浓度为200 mg/mL[26]，并计算提取效率。

提取效率（mL/g）＝提取母液量/称取中药材的量[21]

1.2.5 醇提物抑菌活性的测定

用接种环将培养3 d的菌株转移至试管中，加入无菌水，稀释成浓度为1×105cfu/mL的菌液。抑菌活性采用琼脂扩散法进行测定[27]，即移取150 μL菌液，用涂布器将其均匀涂布于PDA培养基上，再在培养基上打3个孔，孔径为85 mm，将中药提取物注入孔中，加满且不得溢出。以80%乙醇作为对照（CK），每组重复3次。将培养皿置于25 ℃恒温箱中培养48 h后，用游标卡尺测量记录抑菌圈直径。

1.2.6 醇提物MIC值及EC50值测定

采用菌丝生长速率法进行测定[28]。选取抑菌效果最佳的2种植物提取物，采用二倍稀释法依次将其稀释为最终浓度16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0 mg/mL的含药平板，每组接种一块直径5 mm的菌饼，每组重复3次，置于25 ℃恒温箱中培养。用十字交叉法测菌落直径，菌丝不生长的最低浓度为提取物对病原菌的最低抑菌浓度（MIC）。计算不同时间（48 h/72 h）的抑制率，在DPS软件中求出毒力回归方程（y＝a＋bx）、抑制中浓度EC50以及相关系数。

抑菌率＝(对照组菌落直径－处理组菌落直径)/(对照组菌落直径－菌饼直径)×100%

1.2.7 数据处理

数据整理用Excel 2010，显著性检验在DPS数据处理系统中进行，多重比较用Duncan's新复极差法（SSR法）。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态观察及鉴定

在PDA培养基上，葡萄灰霉病病原菌落形态呈絮状，形成大量气生菌丝。随培养天数增加，菌丝由白色逐渐转变为灰褐色，后期形成不规则状的黑褐色菌核，主要分布于培养皿边缘。灰葡萄孢分生孢子梗尖端呈不对称分叉，末端膨大，着生无色至浅褐色的分生孢子，孢子呈椭圆形或卵形，成熟后似葡萄穗状。菌丝自分生孢子梗处延续生长，可成串。

将分离所得灰霉菌菌株用刺伤接种法接种到新鲜健康的葡萄叶片上，6 d后可观察到接种部位出现淡黄褐色“V”字病斑，病斑边缘不规则，表面生有少量霉状物，发病症状与田间自然条件下一致。再对发病的葡萄叶片进行病原菌取样再分离，所得菌株形态与原接种菌落形态相同，由柯赫氏法则确定分离的菌株为葡萄灰霉病病原菌。

利用SCAR标记对分离的葡萄灰霉病病原菌进行检测，引物ITS-1/ITS-4、Bc-f/Bc-r、Bps-f/Bps-r、Bsa-f/Bsa-r、Bsp2-f/Bsp2-r检测所分离的菌株，只有真菌通用性引物ITS-1/ITS-4和Bc-f/Bc-r引物扩增出目标条带，且片段与预期大小一致，其它引物未扩增出任何片段。结合病原菌的菌落形态特征和SCAR标记检测结果，确定在四川成都葡萄产区所分离到的葡萄灰霉病病原菌均为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。

图1 葡萄灰霉病病原菌的形态及鉴定Figure 1 Morphology and identification of pathogens of grey mold in grape

2.2 致病力鉴定

将灰葡萄孢离体接种不同品种新鲜葡萄叶片，依据叶片上所形成的病斑大小来判断该菌株的致病力强弱。如表2所示，该菌种对不同葡萄品种的致病力存在差异。在第3天，该菌种对‘黑巴拉多’葡萄致病力最强，平均病斑直径为8.233 mm，极显著强于其它品种；其次是‘寒香蜜’‘SO4’‘紫甜’‘维多利亚’‘阳光玫瑰’，平均病斑为6.144～6.833 mm。该病原菌对以上5个品种致病力无显著差异，但极显著强于‘巨峰’‘美人指’和‘醉金香’；而对‘夏黑’和‘巨玫瑰’无明显致病效果。在第6天，该菌种对‘黑巴拉多’‘紫甜’‘寒香蜜’‘SO4’和‘阳光玫瑰’致病力较强，病斑直径为7.267～9.500 mm，均极显著强于其它品种；其次是‘维多利亚’‘美人指’‘巨峰’‘醉金香’和‘夏黑’，对这5种品种的致病力显著强于‘巨玫瑰’；而对‘巨玫瑰’无明显致病性。

表2 灰葡萄孢菌对11个葡萄品种的致病力比较Table 2 Comparison of pathogenicity of Botrytis cinerea against 11 grape varieties mm

2.3 中药提取物对灰葡萄孢的抑制效果

不同植物提取物对灰葡萄孢抑菌效果差别较大，如表3所示。其中，有8种植物具有较强的抑菌活性，其中丁香、厚朴醇提物抑菌效果最好，平均抑菌圈直径分别为49.50、46.07 mm，极显著优于其它中药醇提物及对照；黄连和穿心莲醇提物效果次之，平均抑菌圈为20.70、17.57 mm，二者存在显著差异，但均极显著优于其它中药醇提物及对照；辛夷花、石菖蒲、大黄、金樱子醇提物抑菌效果差异不显著，均有较强抑菌效果；而苦地丁、荆芥、防己、小茴香醇提物对灰葡萄孢无明显抑制作用。从提取率看，2种具有最好抑菌效果的药材丁香、厚朴同时具有较高的提取率，为2.87～3.18 mL/g，经济性较好。

表3 26种中药醇提取物对灰葡萄孢的抑制作用Table 3 Inhibitory effects of alcohol extractions of 26 Chinese herbs on Botrytis cinerea

2.4 丁香、厚朴梯度浓度醇提物对灰葡萄孢的抑制效果

选取浓度梯度为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL的带药培养基，在48 h和72 h的菌丝生长数据进行统计分析，分别求出MIC值、毒力回归方程和抑制中浓度（EC50），结果见表4。在48 h时，丁香和厚朴对灰葡萄孢的EC50分别为0.218、0.420 mg/mL，MIC值分别为2、8；而72 h时，EC50分别为0.291、0.741 mg/mL，MIC值分别为2、16 mg/mL，因此丁香稀释后药效保持度优于厚朴，经济效益较高。两种中药醇提物在48 h作用于灰葡萄孢菌丝的生长情况见图2。

表4 丁香、厚朴醇提物对灰葡萄孢的毒力方程及MIC值Table 4 Toxicity equation and MIC of alcohol extractions of Clove and Magnolia to Botrytis cinerea

图2 丁香、厚朴梯度浓度醇提物对灰葡萄孢菌丝生长的影响（48h）Figure 2 Effects of alcohol extractions of clove and magnolia officinalis at gradient concentration on mycelial growth of Botrytis cinerea（48h）

3 讨论

该研究根据柯赫氏法则、病原菌菌丝和菌核形态特征及SCAR标记检测，对四川成都葡萄产区灰霉病病原菌进行了鉴定，确定所分离到的灰霉病病原菌为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。灰葡萄孢腐生性强，寄主范围广，已报道的寄主就有235种[29]，且致病力差异大。Egashira等[29-30]发现，灰霉菌对栽培种番茄的致病力强于野生种，且随着植株年龄的增大致病力增强，对同一植株的叶片致病力随叶龄的增大而增强。寇宏达等[31]发现，不同菌株对同一葡萄品种的致病力不同，对不同葡萄品种的致病力也不同。本试验对11个不同品种葡萄叶片进行致病力测定发现，该灰霉病病原菌菌株对不同葡萄品种的致病力差异较大，‘巨玫瑰’和‘夏黑’对葡萄灰霉病的抗性较强，‘黑巴拉多’则易感，因此对于‘黑巴拉多’的种植应做好清园工作，且在发芽前采取预防措施；部分品种第3天和第6天平均病斑直径差异较大，这可能是不同品种葡萄对该灰霉病病原菌的抗性呈一定阶段性，即可能在病程不同阶段叶片内含物含量变化或分生孢子大量繁殖，导致抗性发生变化或致病力增强，因此对于‘维多利亚’‘寒香蜜’‘黑巴拉多’品种，若发现感病，应在初期及时进行防治，清除病叶和病穗，以防止病情蔓延。

灰霉病菌是一机会病原菌，作物种质资源中尚未发现抗病的材料，很难培育出抗病品种[32]。天然中药材具有普通化学药剂所不具备的高效抗菌、安全、无残留等特点，能解决病原菌耐药性、环境污染和农残等问题。本研究测定了26种中药醇提物对灰葡萄孢的抑制效果，结果发现，丁香、厚朴醇提物对灰葡萄孢具有极显著的抑菌作用，其平均抑菌圈直径分别为49.50、46.07 mm，48 h的EC50分别为0.218、0.420 mg/mL，且具有较高的提取效率（2.87～3.18 mg/mL），可作为制备防治葡萄灰霉病的植物源农药材料。

本研究中的抑菌试验仅限于26种中药醇提物，有些中药抑菌效果较差，可能是乙醇对中药中有效成分提取有限，需选择多种溶剂进行提取进一步确认；丁香、厚朴醇提物对灰葡萄孢抑菌效果较好，但尚不知其对葡萄生长的生理指标是否有影响；并且灰葡萄孢的致病力检测均在离体条件下测定，未进行田间活体试验。因此，更准确的结果需要扩大中药品种筛选范围，选出高效准确提取中药活性物质的方式，在田间进行活体致病力检测和抑菌试验。