舒马普坦脂质体的处方与制备工艺优化

屈晓梅，强永在

（内蒙古医科大学附属医院药剂部，内蒙古 呼和浩特 010050）

舒马普坦，化学名为3-（2-（二甲胺基）乙基）-N-甲基-1H-吲哚-5-甲烷磺酰胺，对5-HT1D受体具有高度选择性，可收缩颅内血管，改善脑血流供应，因此常用作治疗偏头痛[1]。目前美国FDA批准的剂型有注射剂、片剂和鼻喷剂；国内上市销售的为片剂和胶囊剂，舒马普坦口服给药虽然吸收迅速，但首过效应显著，导致其生物利用度仅为14%[2]；舒马普坦注射剂起效快，但注射部位反应、发热、头晕、恶心、呕吐等副作用发生率较高[3]，影响其临床应用。脂质体（liposome）是由卵磷脂和胆固醇制备而成的一种新剂型，具有双分子层结构，性质类似于细胞膜，囊泡内腔可以包裹疏水性或亲水性药物，可以增加难溶性药物的水溶性、提高药物的稳定性，同时兼有良好的生物相容性、无免疫原性、增强靶向性等优点[4，5]。因此，为提高舒马普坦的治疗指数、降低不良反应发生率，本研究拟采用乙醇注入法制备舒马普坦脂质体，在单因素考察的基础上结合响应面分析法对制备工艺进行优化，并对包封率、载药量、粒径、Zeta电位等制剂学性质进行评价，为开发注射用舒马普坦脂质体提供理论依据。同时通过本研究，丰富舒马普坦临床给药手段，给患者提供更多、更便利的用药选择。

1 仪器与试药

Waters Acquity超高效液相色谱仪（美国沃特世公司），LC-500超声波清洗仪（山东济宁鲁超超声设备有限公司），2000型旋转蒸发器（郑州生化仪器有限公司），ZEN3690粒径测定及ZETA电位仪（英国马尔文公司）。

舒马普坦(广州隽沐生物科技有限公司，含量＞98%，批号JM－6430）；卵磷脂购自阿达玛斯（纯度＞98%，批号011008202）；胆固醇（艾伟拓医药科技有限公司，批号B61251）；乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 舒马普坦的UPLC测定方法

2.1.1 色谱条件[6]Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流动相为乙腈-水（25:75，醋酸调节pH5），流速0.3 mL/min，进样量5μL，检测波长228nm。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密吸取舒马普坦脂质体悬浮液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤后，即得。

2.1.3 标准曲线的建立 精密称取舒马普坦对照品14.6 mg，甲醇溶解并定容至100 mL量瓶，作为对照品贮备液（浓度146μg/mL）。分别精密吸取该对照品贮备液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0mL于10mL量瓶中，流动相定容，即得质量浓度分别为1.46、7.30、14.6、29.2、43.8、73.0μg/mL的系列对照品溶液，按“2.1.1”色谱条件进样，记录色谱峰面积，以峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程为：Y=983.42X+564.2（r=0.9997），结果表明，舒马普坦在质量浓度1.46-73.00μg/mL范围内，峰面积与浓度之间线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 取质量浓度分别为7.30、29.2和73.0μg/mL的对照品溶液注入超高效液相色谱仪，分别连续进样6次，记录舒马普坦峰面积，考察日内精密度，结果RSD分别为0.35%、0.54%和0.42%；另取质量浓度分别为7.30、29.2和73.0μg/mL的舒马普坦溶液，连续测定3天，记录峰面积，考察日间精密度，结果RSD分别为0.57%、0.64%和0.49%。舒马普坦的日内和日间精密度均＜1%，表明精密度良好，满足方法学验证要求。

2.1.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8 h进样5μL，测定舒马普坦峰面积，计算RSD为1.17%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.1.6 重复性试验 取同一批样品6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样5μL，测定舒马普坦峰面积，计算RSD为0.65%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 回收率试验 取同一批已知浓度的舒马普坦脂质体供试品9份，分别加入相当于样品含量80%、100%和120%的舒马普坦对照品储备液，进样测定峰面积，计算加样回收率，结果见表1。结果舒马普坦的平均回收率为98.71%，RSD为1.05%，表明方法准确度较高。

表1 舒马普坦回收率试验

2.2 舒马普坦脂质体的制备[7]

采用乙醇注入法制备舒马普坦脂质体，具体操作如下：精密称取处方量的卵磷脂和胆醇，用适量无水乙醇溶解后，边搅拌边加入溶解舒马普坦的磷酸盐缓冲液（pH 6.6），水浴超声30 min得白色混悬液；在40℃旋转蒸发仪中去除有机溶剂，即得半透明带有淡蓝色乳光的脂质体悬浮液。

2.3 脂质体包封率及载药量的测定[8]

采用超速离心法分离游离舒马普坦和舒马普坦脂质体。精密量取制备好的脂质体悬浮液1.0 mL，甲醇破乳并定容至5 mL量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤后进样测定，带入回归方程计算得到舒马普坦浓度及药物量（W总）；另取等量脂质体悬浮液，离心15 min（转速为10000 rpm）滤过，续滤液进样测定，带入回归方程计算得到游离舒马普坦浓度及游离药物量（W游离），计算包封率（%）=（W总-W游离）/W总×100%，载药量=（W总-W游离）/M总×100%，M总表示脂质体总质量。

2.4 单因素试验

2.4.1 卵磷脂/胆固醇质量比对脂质体包封率的影响 固定舒马普坦/卵磷脂质量比为1:15，磷酸盐缓冲液pH为6.6，水合时间为20 min，超声时间为30 min，旋蒸温度40℃；改变卵磷脂/胆固醇质量比（3:1、5:1、7:1、9:1、11:1）制备脂质体。测得包封率分别为46.21%、58.47%、50.18%、45.27%、41.68%。结果表明包封率随着卵磷脂/胆固醇质量比增加，呈现先增加后降低的趋势，当卵磷脂/胆固醇质量比5:1时，舒马普坦脂质体的包封率最高。

2.4.2 药物/卵磷脂质量比对脂质体包封率的影响固定卵磷脂/胆固醇质量比为5:1，其余条件同“2.4.1”，改变舒马普坦/卵磷脂质量比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25）制备舒马普坦脂质体，测得包封率分别为52.18%、56.39%、59.94%、57.21%、55.38%。结果表明舒马普坦/卵磷脂质量比1:15时，脂质体的包封率最高，比例过高或过低，包封率均下降。

2.4.3 超声时间对包封率的影响 固定卵磷脂/胆固醇质量比为5:1，舒马普坦/卵磷脂质量比为1:15，其余条件同“2.4.1”，超声时间分别设置为10、20、30、40、50 min制备舒马普坦脂质体。测得包封率分别为46.34%、53.66%、63.37%、59.26%、54.31%。结果表明，随着超声时间的延长，舒马普坦脂质体包封率先增大后减小，超声30 min最为适宜。

2.4.4 水合时间对包封率的影响 固定卵磷脂/胆固醇质量比为5:1，药物/卵磷脂质量比为1:15，其余条件同“2.4.1”，水合时间分别设置为20、40、60、80、100 min制备舒马普坦脂质体。测得包封率分别为62.29%、69.32%、65.17%、60.84%、58.59%。结果表明，40 min的水合时间最为适宜。

2.5 脂质体制备工艺优化

2.5.1 试验设计及结果 根据单因素试验结果，选取卵磷脂/胆固醇质量比(X1)，舒马普坦/卵磷脂质量比(X2)，超声时间(X3)和水合时间（X4）4个影响因素，以包封率（Y）为评价指标，采用Box-Behnken设计优化处方工艺，试验设计及安排见表2。

表2 试验因素及水平

2.5.2 模型拟合 实验数据用Design Expert软件处理，包括模型拟合及方差分析，得到回归方程为：Y=-437.547+22.989X1+17.731X2+7.189X3+9.653X4+0.148X1X2+0.096X1X3+0.0637X1X4-0.1195X2X3-0.0035X2X4- 0.0138X3X4- 2.951X12- 0.0848X22-0.1083X32（R2=0.9615，P＜0.0001），表明拟合的模型具有显著性；而失拟项P＞0.05，表明失拟项不显著，综上得出所拟合模型可准确预测实际情况。根据拟合结果，绘制3D效应面图和2D等高线图，分析影响舒马普坦脂质体包封率的因素以及因素间的相互作用，综合效应面、等高线图及方差分析结果，可以发现X1、X3、X4、X2X3、X12、X22、X32、X42的P值均小于0.05，表明其对包封率影响显著。利用Design Expert软件，以包封率最大为指标，预测超声法制备舒马普坦脂质体的最优工艺为：卵磷脂/胆固醇质量比5.4:1，舒马普坦/卵磷脂质量比1:14，超声时间31 min，水合时间42 min，预测包封率为77.01%，按此处方工艺制备3批舒马普坦脂质体，测得包封率分别为76.74%、77.19%和76.84%，平均值为76.91%，RSD为0.32%，与预测值较为接近，说明该模型准确可靠，可以用响应面法对舒马普坦脂质体的处方及制备工艺进行优化。

2.6 脂质体载药量、粒径和Zeta电位的测定

取最优工艺下制备的舒马普坦脂质体，测定计算其载药量为8.42%（w/w）；另将舒马普坦脂质体悬浮液稀释一定比例，用马尔文粒度分析仪测定，结果平均粒径为（172.2±18.4）nm，多分散指数（PDI）为（0.216±0.003），Zeta电位为（-21.3±1.6）mV。

表3 试验安排及结果

图1 包封率与各因素间的3D效应面图

3 讨论

脂质体的制备方法有薄膜分散法[7，8]、乙醇注入法[9]、冷冻干燥法[10]和逆向蒸发法[11]等，预实验中分别用以上几种方法制备舒马普坦脂质体，结果以乙醇注入法包封率最高，且具有操作简便，材料环保等优点，因此确定舒马普坦脂质体制备方法为乙醇注入法。脂质体包封率的常见测定方法有透析法[12]、高速离心法和葡聚糖凝胶小柱法等[13]，透析法需在透析袋内外游离舒马普坦扩散达平衡后进行测定，这一过程需要10 h，等待时间较长。本试验尝试用自制葡聚糖凝胶小柱分离脂质体，结果葡聚糖凝胶对舒马普坦保留率较低，不能将脂质体与游离药物有效分离。高速离心法操作简便，本研究发现高速离心15 min后脂质体可沉积于离心管底部，实现脂质体与游离药物的有效分离，因此本试验选择超速离心法测定包封率。

确定了脂质体的制备方法和包封率的测定方法后，选择卵磷脂/胆固醇质量比，舒马普坦/卵磷脂质量比，超声时间和水合时间4个因素进行单因素实验，初步确定了最优值的范围，在此基础上进行了4因素3水平的Box-Behnken实验设计，得到舒马普坦脂质体的最佳制备工艺，验证试验表明此条件下制备的舒马普坦脂质体包封率为（76.91±0.24）%，与预测值接近，说明预测的工艺合理可行。本方法制备的脂质体载药量略低，可能与卵磷脂用量较高有关（舒马普坦/卵磷脂为1:14），载药量与文献报道接近[14，15]。今后工作需从辅料选择及制备工艺两方面入手，通过考察选择优良的高性能辅料，再经进一步的处方优化，制备出包封率与载药量均高的脂质体。