非小细胞肺癌HIF-1α和CA9表达与PET-CT SUV max的相关性及其对预后的影响

王立红，吕秀云，白 侠，康世荣，所 鸿，徐 鹏，杨 婷

（1.内蒙古医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，内蒙古 呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学附属医院核医学科；3.内蒙古医科大学附属医院胸外科）

乏氧微环境通过复杂机制参与肿瘤的发生发展，并与不良预后密切相关，也是肿瘤对放化疗、免疫治疗、靶向治疗等多种抗癌疗法产生抵抗的重要因素[1]。因此，乏氧检测对肿瘤研究有着重要的意义。乏氧诱导因子-1（hypoxia-inducedfactor-1，HIF-1）是细胞在乏氧应激时产生的转录因子，由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成，诱导参与细胞增殖、凋亡、糖代谢、pH调节和血管生成的多个基因的表达上调，其中HIF-1α在肿瘤发展过程中起到至关重要的作用[2]。一种膜相关的含锌金属酶是碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9，CA9），它在肿瘤酸碱平衡中发挥关键作用，且有利于肿瘤细胞在酸性微环境中生存，增强了其迁移、侵袭和转移的能力[3]，在各种人类肿瘤中过度表达，并与预后和治疗效果相关。本研究采用免疫组化方法分析NSCLC原发灶组织中HIF-1α、CA9的表达与PET-CT SUV max值的相关性及其对病人预后的一些影响。

1 材料与方法

1.1 病例的选择

2015-10～2017-12内蒙古医科大学附属医院45例经活检病理诊断的NSCLC病人，于胸外科进行手术切除治疗，术式为肺叶切除术+淋巴结清扫术，术前未接受任何抗肿瘤治疗。病理切片由2名有经验的病理医师作出诊断。45例病人中，男病人29例，女病人16例，平均年龄为59.1岁，其中鳞癌有17例，腺癌有28例，IA期有31例，IB期有6例，IIA期有3例，IIB期有5例，肿瘤直径（22.80±13.04）mm。术后I期病人均无其他辅助抗肿瘤治疗，II期的8例病人中有6例完成4周期含铂两药化疗方案，有2例未进行化疗。

1.2 病理免疫检测

1.2.1 主要试剂HIF-1α抗体，CA9抗体；FITC标记IgG，HRP标记IgG。

1.2.2 实验方法肿瘤石蜡包埋标本以3μm层厚连续切片，每例标本先进行HE染色作为对照并作形态学判定。采用间接免疫荧光组织化学和免疫酶组织化学染色方法。HIF-1α，CA9一抗以1：100稀释，荧光二抗和HRP二抗以1：300稀释。切片经烤片、脱蜡、微波抗原修复后孵育一抗、二抗。阴性对照：参照HE染色切片，以同一切片内的正常组织细胞作为阴性内对照。空白对照：以PBS缓冲液代替一抗工作液。阳性对照：以试剂公司提供的阳性结果图片作为参照。

1.2.3 结果判读免疫荧光组织化学染色以细胞核为蓝色荧光，CA9阳性着色为细胞膜呈现绿色荧光，HIF-1α阳性着色为细胞核呈现绿色荧光。免疫酶组织化学染色定量分析：HIF-1α以细胞核着色为阳性标记，CA9以细胞膜着色为阳性标记，阳性着色为棕黄色，采用半定量分析方法测定阳性细胞百分比：每组内每个因子每张切片随机挑选不得少于5个200倍视野进行拍照，拍照时要让组织充满整个视野，计算阳性细胞百分比（阳性细胞数/总细胞数×100%），参照Baardwijk等人的判读方法[4]，阳性细胞百分比≥25%判断为阳性。

1.3 PET-CT检查

检查前病人禁食6h以上，血糖＜6mmol/L，静脉注射18F-FDG，由2名以上核医学医师对肺癌病灶进行分析。

1.4 术后定期复查随访

病人术后第1年要每3个月复查一次、第2年要每6个月复查一次，第3年及以后要每年复查一次，复查内容有常规体格检查、胸部CT、腹部增强CT、头颅核磁、骨扫描，浅表淋巴结彩超等。随访时间与病人复查时间同步，随访截止时间为2019-12-31，发生复发、转移事件后随访不终止，发生死亡事件时随访终止。随访内容包括上述检查结果，通过查阅病人门诊、住院病历资料以及电话联系方式进行随访。用无病生存期DFS评估预后，DFS定义为自手术之日起，至出现肿瘤复发、转移、与肿瘤相关的死亡的时间。

1.5 统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件进行分析。采用χ2检验分析各因子表达水平与临床特征的相关性，对于连续数据，不同组间比较采用t检验；采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线图像，并进行Log-rank检验，在单因素分析中P＜0.05的因素可进入多因素回归分析；相关性分析采用Pearson分析，所有检验均为双侧，检验水准为α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料及随访结果

45例病人平均随访时间35个月（8～51个月），中位随访时间36个月，失访0人，最后1次随访时存活42人。45例中共计8例复发（包括转移、死亡病例），其中I期3例均存活，II期复发5例中有3例死亡。45例病人平均DFS 33个月，3年OS 93%。术前肿瘤原发灶直径＞32.5mm组病人DFS较差（P＜0.001）（见图1），临床分期II期组的病人DFS较差（P＜0.001）（见图2）；单因素线性回归显示肿瘤直径、肿瘤分期与DFS呈负相关（P＜0.001）（见表5），病理类型、年龄、性别与DFS无明显相关性（P=0.08，P=0.07，P=0.17）；多因素分析中肿瘤直径与DFS呈负相关，是早期NSCLC根治术后病人预后不良的独立危险因素（P=0.003）。

图1 肿瘤原发灶直径（mm）与无病生存期

图2 肿瘤临床分期与病人无病生存期

2.2 PET-CT SUV max结果

45例病人PET-CT SUV max均数6.95，中位数6.17，生存曲线示SUV＞9.2组病人DFS低于SUV≤9.2组（P＜0.001）（见图3），两组平均DFS为16.9个月vs 37.1个月。SUV max＞9.2组3年OS率66.7%，3年DFS 33.3%；SUV max≤9.2组3年OS 100%，3年DFS 94.4%。复发病人共8例中有6例SUV max＞9.2，其中3例为死亡病例。单因素线性回归分析显示SUV max与DFS呈显著负相关（P＜0.001）（见表5），多因素回归分析显示SUV max是早期NSCLC根治术后病人预后不良的独立危险因素（P＜0.001）（见表6）。

图3 SUV max与病人DFS

2.3 免疫组织化学染色结果（见图4、5）

图4 NSCLC组织CA9免疫组化结果 染色阳性为癌细胞胞膜呈棕黄色（200x）

（1）本研究HIF-1α阳性表达有27例（60%），其中腺癌有13例，鳞癌有14例，CA9阳性表达有21例（46.7%），其中腺癌有9例，鳞癌有12例，HIF-1α、CA9共表达。20例（44.4%），二者在内对照及空白对照组中表达均为阴性。χ2检验、t检验结果显示HIF-1α的阳性表达与性别及病理类型有关（P=0.022，P=0.017）（见表1、2），不受病人年龄、肿瘤分期、肿瘤直径的影响（P＞0.05），HIF-1α在鳞癌中阳性表达率82.4%，在腺癌中阳性表达率46.4%；CA9表达与性别、病理类型、临床分期、肿瘤直径有关（P＜0.05），不受年龄影响（P＞0.05），在鳞癌中阳性表达70.6%，在腺癌中表达32.1%（见表1、3）；（2）HIF-1α、CA9、SUV max之间的相互关系：Pearson相关性分析显示HIF-1α和CA9的表达具有相关性（r=0.693，P＜0.001），HIF-1α与SUV max具有相关性（r=0.783，P＜0.001），CA9表达与SUV max具有相关性（r=0.793，P＜0.001）（见表4）；（3）HIF-1α、CA9与DFS：单因素线性回归分析显示HIF-1α、CA9表达与病人DFS呈负相关（P＜0.001）（见表5）。多因素分析显示HIF-1α、CA9表达不是NSCLC病人预后不良的独立危险因素（P=0.72，P=0.14）（见表6）。

表1 HIF-1α、CA9与临床特征的关系

表4 HIF-1α、CA9、SUV max Pearson相关性分析

表5 单因素线性回归分析

表6 多因素回归分析

3 讨论

在临床实践中，18F-FDG PET-CT成像常被用于恶性肿瘤的诊断、分期、治疗计划和治疗反应监测，肿瘤FDG摄取是肺癌病人预后的重要影响因素[5]。本研究由于纳入样本量较少，且研究对象为早期病人，随访时间短，3年总体生存率高达93%，所以在生存分析中我们通过DFS评判病人预后，根据ROC确立的SUV max的cut off值为9.2，以此分为高低两组病人，生存曲线示两组病人的DFS差异具是有统计学意义的（P＜0.001），＞9.2组病人平均DFS为16.9个月，而≤9.2组病人平均DFS为37.1个月；在单因素分析中SUV max值与DFS呈显著负相关（P＜0.001），多因素分析结果显示SUV max是病人的独立预后因素（P＜0.001），与大部分的研究结果相符[6]，本研究显示SUV max升高提示NSCLC病人预后不良。

图5 NSCLC组织HIF1α免疫组化结果 染色阳性为癌细胞胞核呈棕褐色（200x）

表2 HIF-1α与肿瘤直径、年龄的关系

表3 CA9与肿瘤直径、年龄的关系

18F-FDG摄取作为一种乏氧检测方法，其基本原理是乏氧可增加癌细胞葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶的表达，使葡萄糖氧化向糖酵解方向转变，FDG通过葡萄糖转运体进入肿瘤细胞后，在胞浆中积累，因此PET成像可直接反映肿瘤细胞的葡萄糖代谢活性，识别高代谢的肿瘤亚单位，这些单位更容易局部复发。Pugachev等人发现FDG摄取与肿瘤组织乏氧标记物染色呈正相关[7]，我们的研究也显示HIF-1α、CA9的表达量与SUV max呈正相关（r=0.783，P＜0.001）（r=0.793，P＜0.001）。乏氧微环境是肺癌耐药、预后差的重要原因之一，而SUV max与乏氧标记物HIF-1α、CA9的表达呈正相关，这也进一步印证了SUV max对NSCLC病人预后评估的价值，同时证明了PET-CT在肿瘤乏氧检测中的价值。

HIF-1α、CA9是肺癌发生发展过程中的重要分子事件，它们的表达与血管生成、细胞增殖、凋亡抑制、细胞粘附破坏的蛋白的表达都有相关性。HIF-1α、CA9在肺癌中表达情况的相关研究较多，大部分都得出了它们与肺癌病人不良预后的相关性[8～11]。本研究中HIF-1α阳性有27例（60%）、CA9阳性有21例（46.7%），二者表达呈正相关（r=0.693，P＜0.001），单因素分析显示HIF-1α、CA9与病人DFS呈负相关（P＜0.001），而多因素分析显示HIF-1α、CA9并不是病人预后不良的独立危险因素。笔者认为HIF-1α、CA9在单因素分析中的结果可能与其他因素协同，比如，我们在对临床资料的分析中发现CA9阳性表达组肿瘤直径较大（28.60 vs 17.73mm），CA9表达与肿瘤直径呈正相关（t=2.996，P=0.005），而肿瘤直径与DFS呈负相关，所以CA9的阳性表达对于DFS的作用可能与肿瘤直径密切相关。在免疫组化与临床因素的关系中我们还有一些发现，HIF-1α的阳性表达与病理类型有关，在鳞癌病人中阳性表达率是82.4%，在腺癌病人中阳性率是46.4%；CA9表达与病理类型、临床分期、肿瘤直径都有关，在鳞癌中阳性表达率是70.6%，在腺癌中阳性表达率是32.1%。HIF-1α、CA9在鳞癌中的表达率是比较高的，提示鳞癌的乏氧情况比腺癌更严重，这也可以解释鳞癌更易发生坏死的原因。CA9与肿瘤分期、肿瘤直径的相关性进一步印证了CA9的表达与病人DFS的负相关。

HIF-1α表达的组织定位主要位于肿瘤浸润的边缘部分，呈弥漫性，并不局限于坏死灶，在癌细胞中表达，在间质细胞、癌旁组织也有散在表达，亚细胞定位主要在细胞核，同时也有细胞质表达。CA9表达情况与HIF-1α有所不同，其组织定位多见于肿瘤坏死周围部分，形态呈现局灶性，没有观察到较大面积成片弥漫状的表达，在间质细胞及癌旁组织几乎无表达，其亚细胞定位主要位于细胞膜和细胞质，胞膜表达更为明显。二者在组织中的位置分布以及表达量均有不同，这说明了HIF-1α、CA9在肿瘤中的表达除了受到乏氧直接诱导外，还各自受到其他的通路调控。我们还发现，不论是阳性病例数，还是阳性表达病人组织中的表达量，HIF-1α的表达均高于CA9，这可能是由于乏氧可诱导CA9的表达，而CA9表达在一定程度上依赖于HIF-1α通路[12]。肿瘤乏氧标记物HIF-1α、CA9表达在早期NSCLC病人中具有显著正相关性，并与DFS呈负相关，这也提示了我们乏氧标记物可能成为恶性肿瘤的治疗靶点，事实上，已有乏氧靶向抗癌药物在一些动物实验和临床研究中呈现疗效[13]。所以对病人的肿瘤组织进行HIF-1α、CA9检测有助于判断术后早期NSCLC病人的预后，为临床实践提供理论依据，对高表达的病人可以联合PET-CT SUV max值，对综合判断预后具有重要意义。

应当承认的是，本研究有一定的局限性，样本量较小，特别是大多数为I期病人，回顾性设计可能导致选择或信息偏移，而且组织切片的特点并不能反映整个瘤体的情况，这也是所有病理组织实验的共同缺点。

综上，PET-CT SUV max是早期根治术后NSCLC病人预后不良的独立危险因素，早期NSCLC肺癌组织中乏氧标记物HIF-1α、CA9的检测将为肿瘤靶向治疗提供新思路。PET-CT SUV max、HIF-1α、CA9三者联合检测可能有助于判断早期根治术后NSCLC病人预后。