基于网络药理学探讨芎归汤治疗糖尿病合并冠心病的潜在机制

许鑫 吴坚玲 洪建利 戴新斌

冠心病已成为全球性的健康问题[1]。根据2016年世界卫生组织全球疾病评估报告，在过去10年中，心血管疾病是主要的死亡原因[2]。糖尿病合并冠心病是患者死亡的重要危险因素[3]。我国中草药已有数千年的临床应用史，积累了大量的实践经验，并总结了诸多有效的经典方。中医经方芎归汤由当归和川芎两味中药组成。川芎和当归作为中药常见的药物组合，常用于冠心病、糖尿病等疾病的治疗[4-5]。近年来，网络药理学作为一门新兴的交叉科学在中医药研究领域的应用取得了较大进展。其通过高通量组学分析、计算机技术及网络数据库检索等方法，将中医方剂研究与网络科学、系统生物学、计算机科学和生物信息学相结合，从系统角度和分子水平研究中医方剂的治疗机制[6]，符合中医学整体观念的思想[7]。同时，为中医学从经验医学向循证医学转化提供了一种新的研究范式[8]。本文拟从网络药理学的角度探讨芎归汤治疗糖尿病合并冠心病的潜在机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 芎归汤化学成分与靶点获取 通过检索中药系统药理学分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[9]，分别查找当归、川芎的主要化合物、TCMSP identification（TCMSP ID）、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug likeness，DL）信息，并以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，获取芎归汤活性成分及其潜在靶点。再将筛选出的靶点导入Uniprot数据库进行标准化处理。

1.2 糖尿病合并冠心病的靶点获取 在GeneCards、OMIM、PharmGKB、Therapeutic target database[10]和DrugBank 5个数据库中，分别以diabetes mellitus和coronary heart disease为关键词，检索糖尿病合并冠心病的靶点。

1.3 药物-成分-靶点-疾病网络构建 利用venny 2.1在线工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）得到的潜在靶点与糖尿病合并冠心病靶点作交集，获取芎归汤干预糖尿病合并冠心病患者的潜在靶点。将药物化合物以及潜在靶点等数据导入Cytoscape 3.8.0软件，构建药物-成分-靶点-疾病网络。网络中，以不同形状的节点表示药物、成分、靶点和疾病，节点间的连线表明两者间存在相互作用关系。

1.4 蛋白相互作用网络分析 将得到的芎归汤干预糖尿病合并冠心病的潜在靶点导入到STRING 11.0[11]，物种选择为homo sapiens，设定相互作用阈值置信度＞0.15，并隐藏无互作关系的靶点，构建蛋白-蛋白作用（protein-protein interaction，PPI）网络图。然后，将数据以TSV格式导入Cytoscape 3.8.0软件，借助CytoNCA插件进行核心靶点网络筛选[12]。

1.5 基因本体论（gene ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用R语言clusterProfiler包[13]对芎归汤、糖尿病合并冠心病的潜在靶点进行GO和KEGG通路富集分析。以q值＜0.05为筛选条件，按q值大小，将前10的GO生物过程和前30的KEGG通路可视化。

2 结果

2.1 芎归汤活性成分 见表1。

表1 芎归汤的活性成分

由表1可见，得到9种活性化学成分。其中，川芎7种，当归2种。通过TCMSP数据库查询到潜在靶点69个。

2.2 糖尿病合并冠心病的靶点筛选 见图1。

由图1可见，将芎归汤活性成分的潜在靶点与糖尿病合并冠心病的疾病靶点取交集，得到芎归汤治疗糖尿病合并冠心病的潜在靶点21个：PTGS1、PTGS2、F2、AR、SCN5A、PPARG、F7、KDR、RXRA、ADRB2、NR3C1、PIK3CG、HTR2A、SLC6A4、OPRM1、BAX、CASP3、TGFB1、PON1、ADH1C、ADRB1。

图1 芎归汤治疗糖尿病合并冠心病的靶点韦恩图

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络图构建 见图2。

由图2可见，芎归汤通过川芎萘呋内酯等7种药物成分，作用于PTGS1等21个潜在靶点发挥治疗糖尿病合并冠心病的疗效。

图2 芎归汤成分-靶点-疾病作用网络图（六边形节点代表芎归汤，菱形节点代表疾病，矩形节点代表芎归汤包含的活性成分，椭圆形节点代表作用靶点）

2.4 PPI网络图构建及核心靶点网络图构建 见图3-4。

由图3可见，该网络包含21个节点蛋白，122条相互作用连线，平均节点度为11.6。

图3 芎归汤治疗糖尿病合并冠心病的蛋白-蛋白作用（PPI）网络（节点代表靶点蛋白，边代表蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条多寡代表作用强弱）

由图4可见，PPARG、TGFB1、AR、ADRB2、SLC6A4、PTGS2、PTGS1和CASP3这8个靶蛋白是PPI网络中的核心靶点，在该网络中发挥重要作用。

图4 芎归汤治疗糖尿病合并冠心病的核心靶点网络图

2.5 GO功能分析结果 见图5。

图5 基因本体论（GO）富集分析结果

由图5可见，GO富集分析共得到生物过程1 176个，细胞成分24个，分子功能108个，合计GO条目1 308个。分别筛选生物过程、细胞成分、分子功能前10位的GO条目绘制成气泡图。主要涉及的GO条目包括循环系统中的血管过程、调节血压、脂肪细胞分化、急性炎症反应、一氧化氮-氧化物合酶结合和肾上腺素能受体活性等。

2.6 KEGG通路分析结果 见图6。

图6 京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析结果（AGE-RAGE为晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体；cGMP为环磷酸鸟苷酸；PKG为环磷酸鸟苷酸依赖的蛋白激酶；VEGF为人血管内皮生长因子）

由图6可见，神经活性配体-受体相互作用信号通路、5-羟色胺信号通路、肾上腺素能信号通路、晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（advanced glycation end prod ucts-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE）信号通路、血小板活化、环磷酸鸟苷酸-环磷酸鸟苷酸依赖的蛋白激酶（cGMP-PKG）信号通路、钙离子信号通路、人血管内皮生因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）信号通路、花生四烯酸代谢等信号通路在芎归汤治疗糖尿病合并冠心病的过程中发挥重要作用。

3 讨论

据统计，我国心血管病患者已超2.9亿人，其中罹患冠心病患者人数达到了1 100万人，并以每年20%的速度递增[14]。许多危险因素导致冠心病风险增加，包括糖尿病、高血压疾病和高脂血症等[15]，严重影响患者的生存状态[16]。其中，糖尿病是冠心病发病的重要危险因素。冠心病在糖尿病人群中的发病率是非糖尿病人群的2～4倍[17]。川芎的有效成分主要包括苯酞类化合物、生物碱类、多糖、有机酸及其酯、萜类及其烯醇等[18]，常用于活血行气，祛风止痛。现代药理学研究表明，川芎具有抗氧化、神经保护、抗炎、抗菌、抗增殖和促凋亡活性等作用[19]，是临床上常使用的心血管保护中药之一，也是治疗动脉粥样硬化的处方中广泛使用的药物[20]。当归具有补血活血、调经止血、润肠通便的功效。现代药理研究表明，其具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗肿瘤、平喘、镇痛、抗抑郁和保护缺血损伤细胞等作用[21]。

利用网络药理学方法，本研究从芎归汤的活性化合物、作用靶点和信号通路等多角度、多途径预测了其治疗糖尿病合并冠心病的潜在机制。研究发现，十八碳二烯-[9，12]-酸乙酯、杨梅酮、黑麦草碱、洋川芎醌、川芎萘呋内酯、谷甾醇、脂肪酸、β-谷甾醇、豆甾醇等多种成分均是芎归汤发挥疗效的主要活性成分。证据表明，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者表现出胆固醇合成增加的现象[22]。可见，糖尿病患者可能会增加自身胆固醇的合成，继而引发心血管疾病。研究表明，β-谷甾醇与体重指数、空腹胰岛素及C反应蛋白呈负相关，与高密度脂蛋白胆固醇呈正相关[22]。其具有抗氧化应激、抗炎和抗糖尿病的作用[23]。β-谷甾醇还可通过增加过氧化物酶体增殖物激活受体和葡萄糖转运蛋白4的表达来改善胰岛素抵抗，以此增强血糖的控制[24-25]。豆甾醇是一种常见的具有抗动脉粥样硬化潜力的植物甾醇[26]。口服给予小鼠豆甾醇可显著地减轻其胰岛素抵抗和口服葡萄糖耐量，同时降低空腹血糖水平和血脂指数，并促进葡萄糖转运蛋白4的转运和表达，对2型糖尿病的治疗具有潜在的有益作用[27]。

KEGG通路分析表明，芎归汤可能主要通过5-羟色胺信号通路、AGE-RAGE信号通路、钙离子信号通路等发挥治疗作用。研究表明，5-羟色胺信号参与非糖尿病个体胰岛素分泌的调节，HTR1D和HTR2A的过度表达可能导致2型糖尿病个体胰岛功能的障碍或由于已经出现功能失调的胰岛而表现为过表达[28]。相应地，有学者应用选择性5-羟色胺受体拮抗剂（沙格雷酯）治疗冠状动脉狭窄的糖尿病患者，发现沙普格雷酯治疗可减少糖尿病患者的冠状动脉斑块体积，特别是未钙化的部分[29]。晚期糖基化终末产物（advanced glycation end product，AGE）的积累在体内自然发生，但在糖尿病患者体内加速累积[30]。AGE可通过激活其受体RAGE引发细胞内信号级联反应[31]。级联反应激活时，AGE-RAGE级联刺激生长因子分泌并增加胶原产生同时上调细胞膜上RAGE的表达[32]。由于AGE-RAGE信号通路的激活导致的细胞弹性丧失影响许多组织和器官的生理功能。例如，研究表明，AGE-RAGE信号可通过影响2型糖尿病小鼠冠状动脉血管舒张而导致内皮功能障碍[33]。当激活时，AGE-RAGE级联随后刺激心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变，使得细胞外基质产生增加或纤维化，导致心血管疾病的发展，例如通常在糖尿病患者中观察到的左心室僵硬[32]。因此，糖尿病患者罹患心血管疾病的风险增加，这被认为部分是由于AGE-RAGE信号转导诱导成纤维细胞分化所致[34]。此外，研究表明，钙离子信号通路对胰岛β细胞能否正常发挥释放适当胰岛素的功能至关重要[35-36]。

综上所述，本研究利用网络药理学手段，较系统地分析了芎归汤治疗糖尿病合并冠心病的多成分、多靶点、多途径的潜在机制，为经典方的开发和利用提供了理论基础。当然，本研究尚存在一些不足之处。本研究仅在分子机制上进行了潜在靶点的预测，对于何种成分以何种方式作用于具体靶基因及各通路调节机制等尚需进一步开展试验验证。部分生物利用度较低的药物成分可能通过其他途径，如肠道菌群，发挥疗效机制。因此，本研究可能未能完全阐释芎归汤发挥疗效的机制，未来尚需进一步研究。