多壁碳纳米管基质用于大气压基质辅助激光解吸电离质谱分析小分子化合物

陈思键，赵幻希，吴冬雪，王震寰，李 卓，修 洋，刘淑莹

(1.长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2.长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021)

基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)技术在真空中利用激光辐射使样品从基质中解吸附和离子化，主要用于分析蛋白质等生物大分子[1-3]。大气压基质辅助激光解吸电离(atmospheric pressure MALDI, AP-MALDI)是一种敞开式电离技术，其在大气压环境中电离样品，能够减少由真空导致的样品变化和挥发性分析物的损失，具有操作简单、分析快速等优点[4-5]，现已应用于多肽[6]、寡糖[7]、蛋白质[8]和代谢产物[9]的分析。AP-MALDI的常用基质为有机小分子化合物，如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)等，这类基质容易在低质荷比区(m/z<500)产生基质相关离子的干扰信号，使AP-MALDI在低分子质量化合物的分析中存在限制[10-12]。

多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs)具有独特的电学、光学和物理化学性能[13-14]，能够吸收激光能量并传递给待测物，实现分析物的解吸附与电离，其化学惰性能够降低MALDI MS的背景干扰[15]，已作为分析小分子化合物的基质[16]。然而，由于MWCNTs在水和有机溶剂中的分散性较差，很难将其紧密附着在样品靶上形成均匀的基质层，导致MALDI MS分析的重复性和分辨率较低，极易污染质谱仪。因此，需要进一步功能化MWCNTs以克服这些缺点。Shrivas等[17]将合成的MWCNTs/硫化镉纳米复合材料作为MALDI MS的探针和基质，用于预浓缩和分析多肽和蛋白质。He等[18]合成的聚苯乙烯/氧化碳纳米管膜是测定尿样的优秀基质，可以有效避免吸附物在基质层上分布不均匀而导致的信号强度变化，提高点间的重复性。氧化后的MWCNTs可作为MALDI MS的基质，用于筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂[19]和检测小分子化合物[20-21]，与未处理的本征MWCNTs相比，功能化的MWCNTs具有更好的分散性和亲水性，可以提高分析物的解吸附和电离效率。尽管功能化MWCNTs在MALDI MS分析中表现出了良好的效果，但是作为AP-MALDI MS的基质，仍缺少在大气压环境中快速分析小分子的系统研究。

本研究拟合成3种功能化MWCNTs，即Fe3O4负载的MWCNTs(Fe-MWCNTs)、氧化MWCNTs(o-MWCNTs)和β-环糊精复合MWCNTs(β-MWCNTs)。通过研究这3种功能化MWCNTs和本征MWCNTs作为AP-MALDI MS基质分析氨基酸和生物碱等小分子化合物的性能，比较MWCNTs基质与传统有机基质辅助AP-MALDI离子化的差异，并考察基于MWCNTs基质的AP-MALDI定量分析的线性范围、灵敏度和重复性。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

LTQ XL线性离子阱质谱仪、傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)：美国Thermo Scientific公司产品；AP MALDI UHR离子源：美国Mass Tech公司产品，配有波长355 nm的Nd∶YAG二极管泵浦固体激光器；KM-5200DE型超声清洗机：江苏昆山美美超声仪器有限公司产品；5805型高速离心机：德国Eppendorf公司产品；SI-T256型漩涡混合器：德国IKA公司产品；Milli-Q纯水机：美国Merck Millipore公司产品。

1.2 试剂与样品

1.3 功能化MWCNTs的合成

1.3.2o-MWCNTs的合成 将1.2 g MWCNTs置于250 mL单口烧瓶中，加入90 mL浓硫酸，超声2 h后加入30 mL浓硝酸，超声1 h。将混合物在80 ℃回流2 h，冷却后过滤，用蒸馏水将沉淀物洗涤至中性，50 ℃真空干燥。

1.3.3β-MWCNTs的合成 参照文献[23]的方法，将12 mg MWCNTs和1.1 gβ-环糊精混合，用玛瑙研钵研磨，在开始的10 min内逐滴加入1 mL乙醇，研磨3 h后，75 ℃真空干燥。

1.4 样品和基质的制备

以甲醇溶解脯氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、盐酸小檗碱、哈尔满碱、去甲哈尔满碱标准品，配制成1 g/L储备溶液，然后逐级稀释得到待分析溶液。分别取2 mg MWCNTs、Fe-MWCNTs、o-MWCNTs和β-MWCNTs，超声分散于1 mL甲醇-水溶液(90∶10，V/V)中，形成2 g/L基质悬浊液。分别取10 mg CHCA、THAP，溶解于2 mL 乙腈-水溶液(1∶1，V/V)中，配制成5 g/L基质溶液。

1.5 AP-MALDI MS分析

将1.0 μL基质悬浊液滴加于AP-MALDI靶板上，室温干燥形成基质层，将1.0 μL样品溶液滴加于基质层上，室温干燥后进行AP-MALDI MS分析。离子源最大激光脉冲能量为3 μJ，通过光束衰减器调整激光能量，激光光斑直径小于10 μm。正离子模式下检测采集轮廓图，毛细管温度350 ℃，毛细管电压42 V，质量扫描范围m/z50～500。

1.6 方法学验证

将待测样品的储备液稀释至10.0、30.0、100.0、200.0、300.0 mg/L。分别移取1.0 μL基质悬浊液和样品，滴加于靶板上，测定AP-MALDI MS峰强度，以5个不同浓度标准溶液的峰强度对标准溶液的浓度作图，平行测定3次取平均值，得到不同基质的标准曲线方程和线性范围。将同一样品点分成6个区域，每个区域采集3次样品峰强度并取平均值，以6个区域平均峰强度的RSD值表示点内重复性。利用同一样品连续制备6个样品点，每个样品点采集3次样品峰强度并取平均值，以6个样品平均峰强度的RSD值表示点间重复性。

2 结果与讨论

2.1 本征MWCNTs,Fe-MWCNTs,o-MWCNTs和β-MWCNTs的FT-IR表征

图1 本征MWCNTs(a),Fe-MWCNTs(b),o-MWCNTs(c)和β-MWCNTs(d)的FT-IR谱图Fig.1 FT-IR spectra of intrinsic MWCNTs (a), Fe-MWCNTs (b), o-MWCNTs (c) andβ-MWCNTs (d)

2.2 AP-MALDI MS实验条件的优化

2.2.1激光能量的选择 以脯氨酸、甲硫氨酸、哈尔满碱、去甲哈尔满碱为样品，考察激光能量对样品信号强度的影响，结果示于图2。生物碱的峰强度随激光能量增加而增强，在激光能量60%时达到最高。氨基酸的峰强度随激光能量的增加明显降低，可能是由于激光能量过高导致样品分解。因此，实验选择10%激光能量分析氨基酸，60%激光能量分析生物碱。

图2 激光能量对样品峰强度的影响Fig.2 Effect of laser energy on MS intensity of different samples

2.2.2点样方法的选择 以β-MWCNTs为基质，考察4种不同点样方法对氨基酸和生物碱质谱峰强度的影响：1) 干滴法：将样品滴加在靶板上，立即滴加基质与样品混合后干燥；2) 基质优先法：先将基质滴加在靶板上，待基质干燥后滴加样品；3) 夹层法：先在靶板上滴加基质，待干燥后滴加样品，样品干燥后再滴加一层基质；4) 样品优先法：先将样品滴加在靶板上，待样品干燥后再滴加基质。点样方法对样品峰强度的影响结果示于图3。通过基质优先法得到的样品峰强度最高，表明样品的离子化效率受其与基质的混合方式和激光辐射方式的影响。样品直接受激光辐射比接受基质传递的激光能量的离子化效率更高，且样品与基质之间有明显的界面，比二者充分混合更有利于离子化，这可能是因为MWCNTs基质的吸附性会降低样品的解吸附效率。

注：1.干滴法；2.基质优先法；3.夹层法；4.样品优先法图3 点样方法对样品峰强度的影响Fig.3 Effect of sampling methods on MS intensity of different samples

2.3 AP-MALDI MS分析氨基酸和生物碱

2.3.1不同基质分析氨基酸和生物碱的比较

以Fe-MWCNTs、o-MWCNTs、β-MWCNTs、本征MWCNTs、CHCA、THAP为基质，利用AP-MALDI MS分析脯氨酸、谷氨酸、哈尔满碱和去甲哈尔满碱。各化合物的AP-MALDI质谱图示于图4和图5。在正离子模式下，氨基酸和生物碱主要以[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+等加合离子形式出现。谷氨酸在6种基质中均产生m/z148.2[M+H]+离子，在4种MWCNTs基质中还产生了m/z170.1[M+Na]+和m/z186.3[M+K]+离子。在分析脯氨酸时，除Fe-MWCNTs外，在其他5种基质中均观察到了m/z116.1[M+H]+、m/z138.2[M+Na]+、m/z154.1[M+K]+离子，以CHCA为基质时，还能观察到位于m/z190.3的基质加合离子峰[CHCA+H]+。利用AP-MALDI MS分析哈尔满碱和去甲哈尔满碱时，4种MWCNTs基质均产生了较干净的谱图，除了以本征MWCNTs为基质分析哈尔满碱时出现了[M+Na]+(m/z205.2)离子，其他谱图中均只有[M+H]+离子，且为基峰。以CHCA和THAP为基质得到的谱图较复杂，产生了明显的背景信号或基质相关离子的质谱峰。

2.3.2MWCNTs基质用于AP-MALDI MS分析氨基酸和生物碱 4种MWCNTs基质在低质荷比区域均没有明显的基质和相关离子的质谱峰，背景谱图比有机基质更干净。这是因为MWCNTs和合成的功能化材料具有比有机化合物更高的电离能，在相同的激光能量下不易电离，能够减少MWCNTs基质对分析物的干扰，适用于AP-MALDI分析。以Fe-MWCNTs、o-MWCNTs、β-MWCNTs和本征MWCNTs为AP-MALDI MS基质，分析脯氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、盐酸小檗碱、哈尔满碱、去甲哈尔满碱，得到的质谱峰强度示于图6。4种MWCNTs基质均可以辅助3种生物碱样品在大气压环境下直接电离，产生质谱信号。去甲哈尔满碱的离子化效率低于哈尔满碱和盐酸小檗碱。在检测氨基酸时，Fe-MWCNTs作为基质仅能够辅助谷氨酸离子化，因此不适宜作为氨基酸分析的基质。o-MWCNTs、β-MWCNTs和本征MWCNTs可以有效辅助电离6种氨基酸，且对谷氨酸的电离效率最高。4种MWCNTs基质中，用β-MWCNTs检测氨基酸和生物碱时的质谱峰强度最高。

图6 以Fe-MWCNTs、o-MWCNTs、β-MWCNTs、本征MWCNTs为基质，测定氨基酸和生物碱的峰强度Fig.6 Peak intensity of amino acids and alkaloids determined using Fe-MWCNTs, o-MWCNTs, β-MWCNTs and intrinsic MWCNTs as matrixes

通过比较这几种基质发现，以本征MWC-NTs、o-MWCNTs和β-MWCNTs为基质分析氨基酸和生物碱等小分子，不易受背景信号的干扰，可以得到较干净的谱图。其中，以β-MWCNTs为基质时，待测物的信噪比明显高于其他基质；以CHCA和THAP为基质时，干扰峰较多，不利于分析未知物。因此，本征MWCNTs、o-MWCNTs和β-MWCNTs适合作为分析小分子化合物的基质。

注：a,b,c,d,e,f.谷氨酸；g,h,i,j,k,l.脯氨酸图4 以本征MWCNTs(a,g),Fe-MWCNTs(b,h),o-MWCNTs(c,i),β-MWCNTs(d,j),CHCA(e,k),THAP(f,l)为基质分析谷氨酸和脯氨酸的AP-MALDI质谱图Fig.4 AP-MALDI mass spectra of glutamic acid and proline detected using intrinsic MWCNTs (a, g), Fe-MWCNTs (b, h), o-MWCNTs (c, i), β-MWCNTs (d, j), CHCA (e, k) and THAP (f, l) as matrixes

注：a,b,c,d,e,f.哈尔满碱；g,h,i,j,k,l.去甲哈尔满碱图5 以本征MWCNTs(a,g),Fe-MWCNTs(b,h),o-MWCNTs(c,i),β-MWCNTs(d,j),CHCA(e,k),THAP(f,l)为基质分析哈尔满碱和去甲哈尔满碱的AP-MALDI质谱图Fig.5 AP-MALDI mass spectra of harmane and norharmane detected using intrinsic MWCNTs (a, g), Fe-MWCNTs (b, h), o-MWCNTs (c, i), β-MWCNTs (d, j), CHCA (e, k) and THAP (f, l) as matrixes

2.4 方法学验证

以Fe-MWCNTs、o-MWCNTs、β-MWCNTs、本征MWCNTs为基质，分析谷氨酸和哈尔满碱的质谱峰强度与其样品浓度的线性关系，示于图7。可见，谷氨酸和哈尔满碱在10.0～300 mg/L浓度范围内均显示出良好的线性关系，相关系数R2≥0.996 9。重复性实验表明，4种MWCNTs基质分析9种氨基酸和生物碱样品的点内重复性相对标准偏差(RSD)<4.6%，点间重复性RSD<6.7%，重复性较好。

图7 以MWCNTs为基质检测谷氨酸(a)和哈尔满碱(b)的质谱峰强度与其浓度的线性关系Fig.7 Linear relationships between MS peak intensity and concentration of glutamic acid (a) and harmane (b) determined using MWCNTs-based matrixes

3 结论

以Fe-MWCNTs、o-MWCNTs、β-MWCNTs、本征MWCNTs为AP-MALDI MS基质，分析了氨基酸和生物碱等小分子化合物，并考察了4种基质辅助氨基酸和生物碱离子化的差异。以β-MWCNTs为基质时，所有分析样品均有较高的离子化效率。与有机基质相比，MWCNTs基质降低了AP-MALDI MS分析的背景信号，提高了质谱峰强度、准确性和重复性，为小分子化合物的快速分析提供了有效方法。