ICP-MS顺次分析鸡蛋壳中微量元素

朱腾高，陈 静，吴德波，李发亮，徐加泉

(1.东华理工大学，江西省质谱科学与仪器重点实验室，江西 南昌 330013； 2.江西正谱奕和科技有限公司，江西 南昌 330000)

鸡蛋壳的形成过程为成熟的卵泡进入输卵管，输卵管分泌的蛋白将卵黄包住，然后逐渐下行形成内外壳膜，最后到达子宫部，子宫部利用自身代谢产生的CO2在碳酸酐酶的作用下与水结合成H2CO3，H2CO3解离产生CO32-，CO32-再与血液中的Ca结合形成CaCO3，CaCO3均匀的沉积于蛋壳膜上，形成坚硬的蛋壳[1]。蛋壳从外到内依次为表皮层，栅层和突起层，以及纤维膜层[2]。表皮层是蛋壳最外面的包围部分，主要由含钙盐较多的物质组成；栅层为从内部的突起层发散至表皮层，其形状是板条状晶体结构；突起层为蛋壳内层，蛋壳的晶体发育由此而起，一般为乳状；在蛋壳的内部还有纤维膜层，由蛋白质网状纤维组成。对于一般的鸡蛋壳[3]，表皮层大约厚10 μm，起到防水层的作用，主要由蛋白质类组成(90%)，其他物质是碳水化合物和油脂。栅层和突起层主要由以蛋白质为基体的复合材料组成，包括95%碳酸钙、3.3%蛋白质和1.6%水分。栅层较为致密和坚硬，以弹性较好的多孔质为基体。总体来说，鸡蛋壳的基本成分是CaCO3，含量大约为83%～85%，蛋白质含量为15%～17%，并含有锌、铜、锰、铁、硒等微量元素[4]。分析鸡蛋壳中微量元素，不仅可以判断鸡蛋的质量，如是否重金属超标，还可以鉴别鸡蛋的产地。另外，通过判断鸡蛋壳中微量元素的含量和种类，可以了解母鸡摄入微量元素的情况及母鸡的健康状况。

目前，固体样品中微量元素的分析通常采用强酸或强碱等化学试剂将样品中相应的组分提取出来，制备待测液，然后使用原子发射光谱法(AES)[5]、原子吸收光谱法(AAS)[6]或电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[7]离线检测待测液，获得元素组成及含量信息，但这些离线方法需要繁琐的样品预处理过程，分析效率和通量较低[8]。而激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)[9]、X射线荧光[10]等方法虽然能实现固体样品中微量元素的直接分析，但在定量分析方面存在不足。比如LA-ICP-MS的定量分析需要采用与待测样品基体相匹配的标准样品进行校正，对于许多待测样品来说，获得相应的标准物质非常困难。

本课题组基于前期常压质谱分析基础[11-15]，发展了一种顺次电离质谱分析技术，即基于组分的理化性质，调控试剂与样品进行作用(包括萃取、反应等)，对混杂样品中的组分进行顺次提取。同时，为了提高提取效率，可对体系施加超声、微波、加热等不同形式的能量。顺次提取的组分经不同的电离方式(如电喷雾电离源、电感耦合等离子电离源)电离后进入质谱仪检测。该技术具有仅需少量样品预处理、分析速度快、检测灵敏度高、样品消耗量小等优点，已实现了合金[16-17]、组织[18]、矿样[19-20]等不同混杂样品中有机及无机组分的顺次电离分析。

为此，本研究将基于顺次电离质谱分析技术，建立一种可用于鸡蛋壳中微量元素快速分析的质谱方法。该方法将在ICP-MS前端耦合在线提取装置，将微量待测鸡蛋壳样品放置于在线提取装置中，先后采用水和稀硝酸分别对鸡蛋壳中的微量元素进行提取，提取的组分实时在线传输至ICP-MS进行分析检测，以获取鸡蛋壳中微量元素信息。本文将采用该方法对赣州鲜土鸡蛋、赣州营养鸡蛋、赣州草鸡蛋、毛庵村毛氏鸡蛋以及泰和土鸡蛋不同部位(小头、中部、大头)中15种微量元素(Na、K、Mg、Cr、Mn、Fe、Zn、Cu、Pb、Al、Cd、As、Sn、Ni、Ti)水溶性组分和酸溶性组分进行分析。

1 实验部分

1.1 仪器装置

iCAP RQ电感耦合等离子体质谱仪：美国Thermo Fisher Scientific公司产品，配有Qtegra数据处理系统；顺次电离在线洗脱装置：江西省质谱科学与仪器重点实验室自制；UPHW-111-90T优普超纯水制造系统：四川优普超纯科技有限公司产品。

1.2 材料与试剂

浓硝酸(质量浓度65%，分析纯)：国药集团化学试剂有限公司产品；二次去离子水(18.2 MΩ·cm)：由超纯水系统制备；定量滤纸：杭州特种纸业有限公司产品；氩气、氦气(99.999%)：赣州辉浩气体有限公司产品；塑料尖嘴镊子：使用前用5%稀硝酸清洗。

取2.2 mL 65%硝酸，在搅拌下缓慢滴加至98 mL纯净水中，配制成2%稀硝酸；取5.5 mL 65%硝酸，在搅拌下缓慢滴加至95 mL纯净水中，配制成5%稀硝酸。

赣州鲜土鸡蛋、赣州营养鸡蛋、赣州草鸡蛋、毛庵村毛氏土鸡蛋、江西吉安泰和土鸡蛋：购自当地超市。

1.3 实验条件

雾化气流速1.1 L/min，辅助气流速0.8 L/min，等离子气流速14.0 L/min，透镜电压9.25 V，射频功率1 550 W，模拟检测器电压-1 900 V，数字检测器电压1 000 V，动能歧视(KED)模式，其他条件由质谱仪自动优化获得。

1.4 实验过程

用干净的尖嘴镊子将鸡蛋从中部戳开，倒出蛋黄和蛋清，注意避免污染鸡蛋壳。用尖嘴镊子分别取1 mm×1 mm小头顶部、蛋壳中部(蛋壳高度一半处)、大头顶部的鸡蛋壳，需要去除鸡蛋壳内层的半透膜。

首先，根据所需分析的元素确定特征信号(m/z)；然后，搭建图1装置，淋洗液分别为超纯水和5%硝酸，淋洗液流速0.3 mL/min，输液管路内径0.3 mm，超声功率120 W，加热温度60 ℃，2%稀硝酸以0.3 mL/min流速与提取后的金属溶液进行在线混合，以提供ICP-MS检测所需要的酸性条件。将取好的鸡蛋壳样品直接放置于顺次电离在线洗脱装置中，从0时刻开始，首先采用水溶液作为洗脱剂，对鸡蛋壳进行在线淋洗，以提取样品表面的微量元素组分，然后在线输送至ICP-MS进行检测，实时监测水溶性微量元素组分信号，当信号降至基线后，表示水溶性组分提取结束；然后将水溶液更换为5%稀硝酸溶液，继续淋洗鸡蛋壳，并通过ICP-MS实时监测稀硝酸提取液，以检测鸡蛋壳中酸溶性微量元素组分信息，当组分信号降至基线后，分析结束。

图1 顺次电离分析装置示意图Fig.1 Schematic diagram of sequential ionization analysis device

2 结果与讨论

2.1 鸡蛋壳不同部位微量元素分析

首先选取赣州鲜土鸡蛋，根据顺次电离分析流程，对鸡蛋壳小头、中部以及大头3个不同部位上的Na、K、Mg、Cr、Mn、Fe、Zn、Cu、Pb、Al、Cd、As、Sn、Ni、Ti等15种微量元素水溶性组分和酸溶性组分进行分析。利用质谱高通量的检测特性，通过单次分析流程，可在10 min内获得单个样品中15种微量元素的信息。由于不同鸡蛋壳样品及不同样品的分析时长均存在一定的差异，整个分析过程大约耗时10 min。

鸡蛋中部K元素的顺次电离质谱分析离子流图示于图2。可以看出，在50 s和400 s处有2个明显的信号峰，根据实验分析过程可知，其分别为水溶性和酸溶性钾元素的信号峰。

图2 赣州鲜土鸡蛋蛋壳中部水溶性和酸溶性K组分的顺次电离质谱分析离子流图Fig.2 Extracted ion chromatogram of water-soluble and acid-soluble potassium on the middle part of the eggshell from Ganzhou fresh native eggs

赣州鲜土鸡蛋蛋壳不同部位15种微量元素水溶性和酸溶性组分分析结果示于图3。可以看出，Na是含量最丰富的元素，其次为Mg、Ti、K、Cr、Pb、Fe、Zn、Ni、Cu等元素，几乎观察不到Mn、Al、As、Cd、Sn等元素，而且对于大部分元素，酸溶性组分含量高于水溶性组分。在空间分布上，不同元素在小头、中部和大头3个部位的分布情况不同，如Na、K、Pb在小头部位分布较多， Mg、Ti在中部的分布略多于小头和大头部位，而Cr、Fe在3个部位的分布几乎相同。可见，不同微量元素在鸡蛋壳不同部位的分布具有显著差异。

图3 赣州鲜土鸡蛋蛋壳不同部位15种微量元素水溶性和酸溶性组分检测结果(n=3)Fig.3 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Ganzhou fresh native eggs (n=3)

2.2 不同类型鸡蛋蛋壳表面微量元素分析

为了进一步考察不同类型鸡蛋蛋壳表面微量元素的分布情况，实验选取了赣州营养鸡蛋和赣州草鸡蛋进行顺次电离质谱分析，结果示于图4、图5。从图4可以看出，赣州营养鸡蛋中Na依然是含量最高的元素，其次为Mg、Ti、Cr、Fe、K、Zn、Pb、Ni、Cu、Mn、Al等元素，而几乎未检测到Cd、As、Sn等元素。在形态分布上，不同元素具有不同的分布特征，对于Na、K、Mg、Zn、Pb，其水溶性组分大于酸溶性组分；而对于Cr、Fe、Ti，其酸溶性组分大于水溶性组分。在空间分布上，不同元素也具有显著差别，Cr、Fe、Cu、Pb在小头、中部和大头部位分布差别不大；Na、K、Mg、Ti在中部分布最少，而在小头和大头部位分布较多，但差别不大。

图4 赣州营养鸡蛋蛋壳不同部位15种微量元素水溶性和酸溶性组分检测结果(n=3)Fig.4 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Ganzhou nutritional eggs (n=3)

图5 赣州草鸡蛋蛋壳不同部位15种微量元素水溶性和酸溶性组分检测结果(n=3)Fig.5 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Ganzhou grass eggs (n=3)

从图5可以看出，赣州草鸡蛋蛋壳中微量元素含量最高的依然是Na，其次为Zn、K、Mg、Fe、Ti、Pb、Cu等元素，而Cr、Mn、Al、Cd、As、Sn、Ni等元素的含量非常少。在形态分布上，Na、K、Zn以水溶性组分为主，Mg、Ti以酸溶性组分为主，Fe的水溶性和酸溶性组分含量几乎相同。在空间分布上，Na、K、Zn在小头和中部分布较多，Mg在大头部位分布较多，Fe在中部分布较多，而Ti在小头、中部和大头3个部位的分布几乎一样。

通过对比图3、4、5可以发现，这3种鸡蛋虽然都产自同一地方，但由于养殖方式和喂食原料不同，鸡蛋蛋壳中微量元素的含量、形态以及分布均有显著差异。比如，草鸡蛋中微量元素含量明显高于另外2种鸡蛋；鲜土鸡蛋蛋壳中K主要以酸溶性组分存在，而营养鸡蛋和草鸡蛋蛋壳中K主要以水溶性组分存在；鲜土鸡蛋蛋壳中Mg在中部分布最多，而在营养鸡蛋和草鸡蛋中，Mg在中部分布最少。可见，鸡蛋蛋壳中微量元素信息具有非常明显的“指纹”特性，利用这些特性可以有效区分同一产地不同种类鸡蛋，在质量监控方面具有潜在的应用价值。

2.3 不同产地鸡蛋蛋壳表面微量元素分析

为了进一步考察不同产地鸡蛋蛋壳中微量元素的差别，选取了毛庵村毛氏土鸡蛋和江西吉安泰和土鸡蛋进行分析，结果示于图6、图7。从图6可以看出，毛庵村毛氏土鸡蛋中Na依然是含量最高的元素，其次为Mg、Ti、Cr、Zn、K、Fe、Pb、Cu等元素，而Mn、Al、Cd、As、Sn、Ni元素含量非常少。在形态分布上，Na、K、Zn、Pb、Cu均以水溶性组分为主，Mg、Cr、Ti以酸溶性组分为主，而Fe的水溶性和酸溶性组分几乎相同。在空间分布上，Na主要分布于大头部位，Zn主要分布于小头部位，Mg、Cr、Fe、Ti在中部的含量最低，而在小头和大头部位的分布相差不大。

图6 毛庵村毛氏土鸡蛋蛋壳不同部位15种微量元素水溶性和酸溶性组分检测结果(n=3)Fig.6 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell of Maoancun Maoshi native eggs (n=3)

图7 泰和土鸡蛋蛋壳不同部位15种微量元素水溶性和酸溶性组分检测结果(n=3)Fig.7 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Taihe native eggs (n=3)

从图7可以看出，泰和土鸡蛋蛋壳中Na依然是含量最高的元素，但是Ti、Mg、Cr、Fe等元素的比例相比于毛庵村毛氏土鸡蛋和赣州土鸡蛋都有明显增加，Al、Cd、As等元素含量依然很低。在形态分布上，Mg、Cr、Fe、Pb、Ti均以酸溶性组分为主，而K、Zn以水溶性组分为主。在空间分布上，Na、K、Cr、Fe、Pb等在小头、中部和大头部位的含量相差不大，Mg、Zn在中部含量略高于两端，Ti在大头部位的分布最多。

对比图3、6、7可以发现，不同产地同类鸡蛋蛋壳中微量元素的含量、形态、分布具有显著差异，不同鸡蛋之间具有特征的微量元素信息“指纹”，利用这些指纹信息，可有效区分不同产地的同类型鸡蛋。

2.4 显著性差异表征

为了表征不同种类鸡蛋之间结果的差异性，采用平均值±标准差表示连续变量，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较5种鸡蛋之间各元素含量的差异，所有的数据统计分析均在IBM SPSS 22.0软件上完成。5种鸡蛋不同部位酸提取和水提取的显著性差异表征结果示于图8。可以看出，分析结果之间具有显著差异，p值均小于0.001，表明由微量元素构成的“指纹谱”可用于鉴别鸡蛋的来源和品质。

注：a.小头(水)；b.中头(水)；c.大头(水)；d.小头(酸)；e.中头(酸)；f.大头(酸)；*代表p<0.001图8 5种鸡蛋不同部位水提取及酸提取微量元素分析结果差异性Fig.8 Difference of the analytical results of the trace elements extracted from different parts of 5 kind of eggs

导致不同种类鸡蛋蛋壳中金属元素不同的因素很多。根据蛋壳的形成过程可知，其中的金属元素主要来源于血液，而血液中的金属元素主要来源于摄取的食物和水。其中，对于养殖鸡，其差异主要取决于饲料和水；而对于放养鸡，由于其食物来源较复杂，将具有较强的地域特色。此外，由于运动、光照等因素会影响金属元素的吸收，也是导致血液中金属元素含量不同的原因。实验结果表明，赣州草鸡蛋蛋壳中的微量金属元素含量显著高于其他种类鸡蛋，这与其放养过程中食物的复杂性和运动有关，其在放养过程中会大量摄入环境中的食物和水，其金属含量将高于饲料中的金属含量，而且运动有助于提高食物的摄入量。

3 结论

本工作耦合在线提取与ICP-MS分析，发展了一种鸡蛋壳中微量元素顺次分析的质谱方法。该方法具有样品预处理少、分析速度快(10 min)、样品消耗量小(1 mm×1 mm)、元素信息丰富(15种微量元素水溶性和酸溶性信息)等优点。采用该方法成功获得了赣州土鸡蛋、赣州营养鸡蛋、赣州草鸡蛋、毛庵村毛氏土鸡蛋、吉安泰和土鸡蛋中15种微量元素含量、形态及分布信息。结果显示，整合鸡蛋蛋壳上微量元素的含量、形态和分布信息可构建鸡蛋“指纹谱”，该“指纹谱”与鸡的饲料、水、运动、光照等因素有关，不同种类鸡蛋的微量元素“指纹谱”具有显著区别(p<0.001)，该“指纹谱”可为鸡蛋种类鉴别和质量鉴定提供参考。

致谢：感谢国家钨与稀土产品质量监督(赣州)检验中心为本工作提供的帮助。