实时直接分析质谱结合固相微萃取分析卷烟主流烟气粒相物

耿 欣，王新新，李红丽

(南京师范大学化学与材料科学学院，江苏省生物医学功能材料协同创新中心，江苏省生物医学材料重点实验室，江苏 南京 210023)

吸烟不仅可以引起慢性肺病、肺癌，还与心血管疾病、脑中风、慢性支气管炎等多种疾病相关[1-2]。卷烟烟雾是包含6 000多种化学物质的复杂混合体系，通常分为主流烟气(MSS)和侧流烟气(SSS)两种。MSS可以直接进入人体，其中含有大量的一氧化碳(CO)、多环芳烃、亚硝胺、挥发性羰基化合物和挥发性酚等强致癌物质，对人体健康产生极大危害[3-4]。因此，建立香烟主流烟气中物质成分的高效分析方法，对研究和理解吸烟对人体健康的影响极为重要。

主流烟气(MSS)是一种气溶胶颗粒，由颗粒物和气相物组成。剑桥滤片将大于0.1 μm的粒相物截留，气相部分则能通过滤片[5]。目前，主流烟气的分析方法主要有光学分析法[6]、色谱法[7]和质谱法等[8]。其中，光学分析法简单、快速，但不适用于复杂样品体系中多种物质的分析；色谱法分离耗时，方法建立和优化繁琐，且单一色谱分析对复杂基质样品的定性能力差；质谱法是物质鉴定和结构解析强有力的工具，通过与色谱联用可对样品进行分离和分析。然而，在色谱-质谱联用中，受色谱时效的限制，分析效率有待提高[9]。原位电离质谱(AIMS)可在环境条件下，将样品直接暴露于电离介质中进行电离和分析，操作简便[10-12]。实时直接分析离子源(DART)是Cody等[13]于2005年开发的一种原位电离离子源，其在大气压环境下进行操作，无需或仅需简单的样品前处理，可直接对固体、液体、气体样品进行快速电离和直接分析[14]。DART离子源通过由辉光放电产生的激发态等离子体热气流对化合物进行热脱附，然后与样品之间进行潘宁电离(PI)使样品离子化。近年来，DART已经应用于食品、医药、卫生等多个领域[15]，但主要用于特定目标物的筛查分析。本课题组[16-17]使用DART-MS分析了主流烟气的成分，结果表明，本方法对复杂样品体系有较好的分析能力。

卷烟烟气是一个复杂的样品体系，物质种类多，且多个物质的成分含量低。样品富集是烟气成分分析的重要步骤。固相微萃取(SPME)由Furton等[19]在20世纪90年代建立。最初是为了缩短气相色谱(GC)的样品前处理时间，通过在石英玻璃纤维上涂有一定的固定相，对样品进行富集和纯化，主要用于气相色谱分析中的顶空富集[18]。当SPME探针表面涂有不同材料的涂层时，如C18(非极性)、PDMS/DVB(极性)可对不同性质的物质萃取富集[20-21]。SPME具有样品用量少、提取效率高、方便快捷等特点，已在多个领域的复杂基质样品前处理过程中展现出独特的优势[22]。样品前处理技术与DART-MS的有效结合，对提高卷烟烟气成分的分析性能非常重要。

本工作拟以主流烟气粒相物为研究对象，采用SPME与高分辨DART-MS直接耦合的方法分析复杂卷烟烟气成分。采用SPME探针对样品直接富集，在DART离子源中，使SPME上吸附的物质快速解吸附并电离，使用高分辨质谱进行检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

实时直接分析离子源(DART-SVP)：美国Ion Sense Inc公司产品；高分辨率Orbitrap Fusion Lumos质谱仪：美国Thermo Fisher Scientific公司产品；Whatman 44 mm剑桥滤片：英国Whatman公司产品；10 mL注射器：江苏科勒医疗器械有限公司产品；TGL16M离心机：湖南湘立科学仪器有限公司产品；亲水PTFE针式滤器：上海安谱实验科技股份有限公司产品；电子分析天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司产品；水浴恒温振荡器：上海百典仪器设备有限公司产品；MX-S型涡旋振荡器：美国Scilogex公司产品；微型振荡器(micro plate shaker)：印度Euation公司产品；D3820-07方孔型96孔深孔板：上海阿拉丁生物科技有限公司产品。

1.2 主要材料与试剂

甲醇(CH3OH)、乙腈(CH3CN)：高效液相色谱纯，美国Sigma公司产品；纯净水：南京娃哈哈有限公司产品；乙酸铵(CH3COONH4)粉末：南京晚晴化玻仪器有限公司；标准研究香烟(1R5F)：美国肯塔基大学产品；混合型香烟1、混合型香烟2、烤烟1、烤烟2、雪茄：均购自超市，使用前于-20 ℃冷藏48 h；65 μm PDMS-DVB SPME探针和C18 SPE-it探针：美国Supelco公司产品。

1.3 样品制备

1.3.1主流烟气粒相物溶液的制备 以混合型香烟1为例，将直径为44 mm的剑桥滤片放置于卷烟夹持器中，卷烟夹持器一端插入香烟，另一端连接10 mL注射器。用电动打火机点燃香烟，拉动注射器的活塞后，随着主流烟气气相物收集到注射器中，主流烟气中的粒相物质被拦截收集到剑桥滤片上(该过程共抽吸1支香烟)。配制0.1 mol/L乙酸铵溶液，将截留有MMS粒相物的剑桥滤片放到离心管中，加入50 mL乙酸铵溶液，用水浴恒温振荡器振荡30 min，萃取结束后弃去剑桥滤片，离心5 min后取上层清液，最后用过滤膜过滤3次，得到MMS粒相物母液。测试时，在MSS粒相物母液中加入甲醇进行稀释。同一样品重复3次，其他的卷烟进行相同处理。

1.3.2固相微萃取过程 以C18涂层的探针为例，首先将SPME探针浸入1.5 mL 50%乙腈溶液中润湿30 min，随后快速转移至母液中，进行20～60 min的样品富集，然后在水中洗涤10 s，去除杂质，最后将SPME探针拿出晾干，待DART-MS检测。SPME探针的润湿、富集和杂质清洁均在置于微型振荡器的96孔板上进行，振荡速率1 500 r/min。使用PDMS涂层的探针，用乙腈作为溶剂清洁洗涤。检测后的SPME探针可放在装有1 mL乙腈(C18涂层)或水(PDMS涂层)的液相色谱小甁中，置于微型振荡器上洗脱60 min，实现SPME探针的再生和重复使用。

1.4 DART-MS分析

1.4.1样品分析 DART-MS直接进样分析：使用移液枪吸取1 μL主流烟气粒相物液体样品，移至DIP-it玻璃棒底部，将玻璃棒放在移动的滑轨上，放置12个样品(Ion Sense, Inc.)。第1个样品为空白溶剂，收集背景信号。

DART-MS结合SPME分析：将富集后的SPME探针放在可承载12个SPME探针的滑轨上。第1个样品为空白的SPME探针，收集背景信号。为避免交叉污染，每根SPME探针样品间隔放置。

1.4.2仪器检测条件 使用高纯氦气(99.999%)进行DART-MS分析，而氮气(99.999%)用于待机模式。正离子模式下，在m/z50～300质量范围内获取质谱数据。Orbitrap分辨率设置为60 000，离子转移管温度300 ℃，最大离子注入时间100 ms，自动增益控制(automatic gain control, AGC)目标2×105。吸附后的SPME探针进行多次分析(n≥3)。

1.5 数据分析

使用Tune plus收集MS数据，Xcalibur 2.1软件处理，所有实验谱图都使用Origin 8.0绘制，根据高分辨质谱得到的m/z值推断化合物的分子式。

2 结果与讨论

2.1 SPME-DART-MS方法流程

卷烟主流烟气粒相物的原位电离质谱分析流程图示于图1。通过卷烟夹持器，卷烟MSS粒相物被截留在剑桥滤片上，使用乙酸铵水溶液溶解滤片上的截留物，获得MSS粒相物母液。固相微萃取过程在96孔板上进行，可同时对12个样品进行富集和纯化。吸附后的SPME探针直接放置在DART离子源的样品轨道上，多个SPME探针依次通过DART离子源中心。在DART离子源热的等离子体气流作用下，SPME探针上的物质被快速解吸附、离子化，然后进入质谱检测。本方法中SPME所有步骤可在96孔板上完成，操作简单；采用的SPME探针可以直接与DART离子源耦合，无需洗脱和其他中间步骤。DART离子化在大气压条件下进行，单个SPME探针的分析时间在10～20 s，分析速度快，并且可以自动进样。SPME与DART-MS联用可提高复杂样品中物质的分析效率，步骤少、简单快速，可实现多个样品的高通量分析。

图1 SPME-DART-MS方法的整体流程图Fig.1 Overall protocol of SPME-DART-MS method

2.2 SPME-DART-MS分析条件优化

本工作优化了SPME过程的萃取条件和DART离子源参数，选用C18涂层的SPME探针和混合型香烟1的粒相物溶液。在SPME中，分别选取萃取时间10、20、30、60 min对样品成分富集，将萃取后的SPME探针进行DART-MS分析，选取强度较高的离子对其信号峰进行积分，结果示于图2a。可以看出，在10～60 min萃取时间内，样品信号响应并无太大变化。由于SPME探针表面涂层具有一定的饱和度，在探针萃取达到饱和后，即使延长样品提取时间也不会提取更多的样品。在SPME样品处理过程中优化了样品溶液的稀释倍数，分别采用母液(无稀释)、稀释2倍、稀释5倍、稀释10倍的溶液，选定样品离子的积分信号强度与稀释倍数的关系示于图2b。可以发现，选定的稀释倍数对样品中离子信号的强度无明显影响。此外，在混合型香烟2的萃取时间和样品浓度优化中表现出相似的结果(数据未展示)。事实上，对于SPME萃取，样品浓度还有进一步稀释的空间，然而，为了兼顾后续实验中与DART-MS直接分析的对比，稀释倍数不宜太大。

注：a.SPME萃取时间；b.MSS粒相物溶液稀释倍数；c.导轨移动速率；d.氦气加热温度图2 SPME-DART-MS分析主流烟气粒相物的实验条件优化(混合型香烟1)Fig.2 Optimization of experimental conditions for analyzing mainstream smoke particulate matter by SPME-DART-MS (mixed cigarette 1)

在DART-MS进样时，多个SPME探针置于自动滑轨上，按照一定的速率把探针传输至DART离子源中心，滑轨移动速率直接影响样品暴露在高温等离子体流中的时长。本实验分别采用0.2、0.3、0.5、0.7 mm/s的轨道线性移动速率，通过对比特定离子积分信号强度后发现，当滑轨移动速率越大(即SPME探针停留在电离区域时间越短)，信号越低，示于图2c。在DART-MS分析时，氦气经离子源被加热，对SPME探针上吸附的物质进行热解吸后再电离。本实验选择250、300、350、400 ℃加热温度比较相应物质的积分信号强度，得到的氦气温度优化图示于图2d。氦气温度在250 ℃的信号比其他温度的信号略低，300～400 ℃时的信号无明显差别。需要说明的是，实时直接分析离子源中的氦气主要通过形成高温等离子体流对样品进行解吸附电离。电离后的样品在DART与质谱之间的VapurTM接口上外接真空泵形成的负压作用下，进入质谱检测。该实验使用商用DART离子源，氦气流量无法改变，流量大小应处于最佳状态，故未对其进行优化。

综上，本实验采用SPME探针萃取20 min、样品母液稀释5倍、样轨道移动速率 0.2 mm/s和氦气加热温度350 ℃。

2.3 SPME-DART-MS分析主流烟气粒相物

本研究中SPME探针包含C18和PDMS-DVB涂层，其吸附材料分别有利于非极性和极性化合物的提取，采用DART-MS玻璃棒直接分析和使用不同涂层的SPME探针吸附后对制备的标准香烟MMS粒相物溶液进行分析，其质谱图示于图3。从图3a可以看出，DART-MS直接分析检测到的物质主要集中在m/z250以下，其中m/z163.12主要为尼古丁等烟碱物质，信号较强，在一定程度上抑制了其他物质的信号。采用SPME-C18进行样品富集后，多个物质的信号都得到了增强，尤其是m/z163.12后的离子信号，示于图3b。

注：a.DART-MS直接分析；b.DART-MS结合SPME-C18；c.DART-MS结合SPME-PDMS图3 不同分析手段检测标准卷烟MSS粒相物的质谱图Fig.3 Mass spectra of standard cigarette MSS particulate matter using different methods

与DART-MS直接分析相比，烟碱的基质效应明显减小，多种成分的信噪比(S/N)得到了较大提高。PDMS涂层同样表现出对MSS粒相物中多种成分的吸附，加强了质谱分析信号，示于图3c。 整体上，C18材料比PDMS探针表现出更好的萃取效率，吸附了更多成分；其中PDMS富集的部分物质与SPME-C18探针一致。值得注意的是，SPME-DART-MS分析m/z<160的小分子离子峰信号没有明显提高。

使用两种吸附材料探针分别对标准香烟1R5F、混合型香烟2、烤烟2和雪茄烟等4种不同类型的卷烟进行SPME-DART-MS分析，并与DART-MS直接分析的信号(标注为solwtion/soln)进行对比，结果示于图4。选择的目标离子为m/z169.08、183.09、187.12、197.11、201.14，信号强度为提取DART-MS离子流图的积分面积。经过SPME富集，这些离子的质谱信号比直接检测增强了5～20倍，并且C18涂层的SPME萃取能力大于PDMS涂层。同时，SPME对4种不同卷烟的富集效果基本一致，它们之间的信号没有显著差异。此外，通过进一步分析m/z<150的离子峰信号积分强度，如m/z97.08、111.09、123.09等，发现这些离子的信号仍然存在，但SPME过程并没有增强其信号。这可能是因为这些小分子质量化合物不易吸附在探针上或者易挥发，在达到DART离子源中心之前，已经在热的离子源环境中解吸附，扩散至空气中。

根据高分辨质谱得到的精准质量，对检测到的主要质谱峰进行分子式、离子形式和化合物的推断，结果列于表1。卷烟烟气成分存在大量的结构异构体，原位电离质谱检测到的单一质谱峰可对应多个物质。这些物质主要为烟碱、吡啶、苯、吲哚、胺、醇、酚类等有机化合物。表1中所列的质谱峰小于m/z300,所推断的物质质量差(测定的分子质量-精确分子质量)小于1×10-3Dalton,准确度较高。为进一步验证实验结果，选取1-甲基咪唑(1-methylimidazole)、2-氨基苯乙腈(2-aminobenzeneacetonitrile)、萘胺(naphthylamine)、8-氨基喹啉(8-aminoquinoline)、去甲烟碱(nornicotine)、1，8-二氨基萘(1, 8-diaminonaphthalene)、4-氨基联苯(4-aminobiphenyl)和尼古丁(nicotine)等8种标准品进行DART-MS分析，信号响应主要为[M+H]+离子形式。通过与烟气样品数据比对，由精准质量推断的化合物与标准品一致，该结果与文献[23-28]报道一致。

表1 SPME-DART-MS检测MSS粒相物中主要离子的化合物推断Table 1 Compound identification of main ions in MSS particulate matter detected using SPME-DART-MS

DART-MS直接分析可以快速分析MSS粒相物成分，结合SPME富集后，不仅可降低复杂MMS样品中尼古丁离子的基质效应，同时增强了多种成分的信号，尤其是相对含量较少的物质。本文中的SPME操作和DART-MS均具有快速、简单、高通量的特点，两者的结合可简化常规分析步骤，提高MSS粒相物的分析检测效率。

注：a.标准烟1R5F；b.混合型香烟2；c.烤烟2；d.雪茄图4 DART-MS和SPME-DART-MS对不同卷烟MSS颗粒物分析的信号比较Fig.4 Signal comparison of DART-MS and SPME-DART-MS methods for the analysis of MSS particulate matters of different cigarettes

2.4 DART-MS对SPME探针解吸附效率的研究

SPME探针上化合物的洗脱是在DART离子源中快速(10～20 s)完成的，为了探究洗脱效率，对已提取MSS粒相物的两种涂层的SPME探针进行了连续多次的DART-MS分析。C18探针和PDMS探针富集了不同卷烟的MSS粒相物之后，在DART离子源中连续5次解吸附后的离子信号强度示于图5。可见，第一次解吸附后检测到的信号最强，后续多次的解吸附仍然有信号残留；与第一次解吸附相比，后续的离子信号强度大幅度下降。对于C18探针(图5a和图5b)，第二次解吸附离子积分信号强度约为第一次的1/3，而PDMS吸附探针(图5c和图5d)第二次解吸附产生的信号约为第一次的1/5。随着分析次数的增多，离子积分信号强度逐渐变弱但下降幅度不大。经过5次分析之后，SPME探针还有吸附物残留，这可能是由本研究使用的样品浓度过高(母液的稀释倍数小)引起的。本文图中的实验结果均采用第一次解吸附的离子峰信号。这种连续性解吸附实验表明，SPME探针具有长期耐用性，在经过不同溶剂洗涤后，可以重复使用。综上，无论是哪种涂层的SPME探针，在DART离子源中第一次解吸附时就已经实现了最大的、有效的传质，大部分物质都可以被DART离子源解吸附并离子化。

3 结论

本研究建立了一种固相微萃取结合实时直接分析质谱法，分析卷烟主流烟气粒相物。SPME技术不仅可以增强复杂基质样品中多种成分的检测信号，还可以降低待测样品中主要物质的信号抑制效应。与直接DART-MS分析相比，SPME-DART-MS大大提高了对复杂样品中多种物质的检测能力。结果表明，DART离子源对SPME探针上的物质表现出较好的解吸附效率。该方法简单、快速、可实现高通量分析。