破壁前后油菜蜂花粉中黄酮类化合物定性定量分析

肖兴英 乔江涛 张红城

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093）

油菜蜂花粉为十字花科芸薹属植物油菜（Brassica campestrisL.）的蜂花粉粉末，是我国蜂花粉重要的大宗交易品之一[1]。油菜蜂花粉具有抗前列腺炎、抗衰老及美容养颜等作用，其中主要含有氨基酸、脂肪酸、矿物质、植物甾醇[2,3]、类黄酮、酚酸衍生物糖苷等植物次级代谢产物[4,5]。黄酮类化合物广泛存在于蜂花粉中，具有降血脂血压、抗动脉硬化、抗炎等作用，可以参与机体的氧化应激、清除羟基、DPPH自由基[6]，因而在预防糖尿病、心血管疾病等方面发挥作用[7]。目前，蜂花粉中的黄酮类物质研究是一热点，对油菜蜂花粉中破壁前后黄酮类化合物成分含量变化的报道尚不全面。本文在实验室已有的研究基础上[8]，采用高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱法（HPLC-QTOFMS），对油菜蜂花粉中的黄酮类化合物进行结构鉴定，并对比蜂花粉破壁前后的成分变化，以期为油菜蜂花粉黄酮类成分的生物活性及药理学作用研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

分析纯甲醇、无水乙醇、甲酸、维生素C、维生素E 购自北京索莱宝科技有限公司；色谱级甲醇、乙酸、质谱级乙酸、磷酸盐缓冲液购自美国Fisher 公司；槲皮素-3-O-槐糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷购自美国Sigma 公司；实验用水为超纯水。

1.2 实验材料

油菜蜂花粉样品为2018年、2019年、2020年采自江西婺源、江岭、青海门源等地区，样品采集后存放于4℃冰箱备用。

表1 油菜蜂花粉样品信息

1.3 实验仪器设备

Sorvall ST8 ST8R 型台式离心机，美国Thermo Fisher 公司；无菌注射器，江苏正康医疗器械有限公司；0.22μm 微孔滤膜，Milipore 公司；移液器，美国Thermo 公司；JC-QXS-4.5L 型数控超声波清洗器，中国昆山市超声仪器有限公司；超纯水系统，Merk Millipore 公司；LC-6AD 高效液相色谱仪，日本岛津公司；AVANCE III 500MHz 核磁共振波谱仪，配有低温探头（Bruker）；AD-9925 型真空泵，天津奥特塞恩斯仪器有限公司；氮吹仪，冠森生物科技上海公司；高效液相色谱仪和6520四级杆-飞行时间质谱（Q-TOF），美国Agilent 公司；JECHERS 自动样品制备系统，中国上海净信实业发展有限公司；Thermo Sorvall Biofuge Startos 型台式离心机，美国Thermo Fisher 公司；DCTZ-100 三频多用途恒温超声提取机，北京弘祥隆生物技术开发有限公司；FA2 弗鲁克高剪切分散乳化机，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；LGJ-18S 真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；AL104 电子天平、Seven Easy pH 计，Mettler-Toledo 公司。

1.4 方法

1.4.1 蜂花粉的破壁处理

称取80g 油菜蜂花粉于1000mL 烧杯中，加入800mL 超纯水，搅拌溶解。向溶液中加入磷酸盐缓冲液pH 值至3.50，加入2.0g 维生素C、0.4g 维生素E 后，采用超声-高剪切联用法进行破壁处理。首先，高剪切处理，溶液放置在冰浴中，转速为25000rpm，时间为50s。其次采用超声破壁处理，超声功率为1000W，超声频率为80Hz，超声温度为20℃，采用间歇超声法，即超声20min 停歇半小时，总超声时间为4h。最后，将破壁处理的样品真空冷冻干燥至恒重，-18℃冰箱中保存备用[8]。

1.4.2 蜂花粉样品前处理

称取3g 油菜蜂花粉置于50mL 离心管中，用75%乙醇溶解并定容至30mL。离心管中加入标准转子后放入自动样品制备系统，频率60Hz，运行时间120s。取出转子，蜂花粉悬浊液配平后在5000r/min 条件下离心10min，之后除去蜂花粉悬浊液中的固体不溶物。取上清液置于样品管中，从样品管中取2mL上清液，0.22μm微孔滤膜过滤后，用于HPLC 分析。

1.4.3 蜂蜜样品的高效液相色谱分析条件

色谱柱：Phenomenex Gemini C18（150mm×4.6mm，5μm）；样品进样量为20μl、油菜蜂花粉的检测波长270nm；柱温箱温度为36℃。流动相A：超纯水（含0.2%的甲酸），流动相B：甲醇（含0.2%的甲酸），总流速0.7ml/min。

油菜蜂花粉的梯度洗脱程序为：0～10min，5%～22%B；10～15min，22%～27% B；15～30min，27%～31% B；30～45min，31%～33% B；45～75min，33%～40% B；75～105min，40%～45% B；105～110min，45%～49% B；110～145min，49%～59% B；145～150min，59%～80%B。

1.4.4 样品质谱分析条件

液相质谱（LC-QTOF）分析条件：离子源为ESI源（电喷雾），离子源喷射电压为4kV，出口电压为130V，加热温度350℃，氮气流速为11L／min，碰撞气体为氦气，雾化气流速为80kPa，雾化器的压力40psi，质量扫描范围m/z=100～900Da。

2 结果与分析

2.1 油菜蜂花粉化合物组成分析

油菜蜂花粉提取物经HPLC分离结果如图1所示，从图中，可以清楚的看到油菜蜂花粉中所含物质丰富，出峰时间紧凑，分别在25min、40min 和105min 成蔟出现，对图1所示所有峰进行出峰时间和紫外光谱对比。根据文献查阅对比、HPLC-MS 鉴定数据对比及标品验证，对图1标注结果化合物1 和化合物2 进行鉴定，结果如表2。

图1 油菜蜂花粉HPLC谱图

表2 正离子模式下HPLC-ESI QTOF-MS/MS油菜蜂花粉中黄酮类化合物

2.1.1 化合物1

图2及表2一级和二级质谱图为化合物1 在正离子模式下的分子离子峰，可知化合物1 的准分子离子峰[M+H]+为627.1554m/z 及[M+Na]+649.1373m/z 的分子离子峰，因此化合物1 的分子量为626Da。通过比对图2二级质谱数据断裂碎片，进一步推测化合物裂解途径论证该化合物结构，其表现为显著的多酚类化合物的电离特征。准分子离子峰[M+H]+(m/z)在断裂1 个葡糖苷（C6H5O10）碎片后，产生分子离子碎片峰[M+H]+465.1022m/z，而后在第二次相继断裂1 个葡糖苷（C6H5O10）碎片，得到分子离子碎片峰[M+H]+303.0498m/z，最终得到相对分子质量303Da 即为槲皮素相对分子质量。结合紫外光谱，化合物1 在255nm 和348nm 处有最大吸收峰，符合多酚类紫外吸收特征。为验证我们的猜测，采用内标法进行标准品验证。标准品为槲皮素-3-O-槐二糖苷（Quercetin 3-O-sophoroside），分子式为C27H30O17，CAS 号为18609-17-1，鉴定结果与文献报道一致[9-14]。因此，化合物1 最终鉴定为槲皮素-3-O-槐二糖苷。

图2 正离子模式下化合物1的质谱图（LC-QTOF-MS/MS）

2.1.2 化合物2

图3和表2一级和二级质谱数据为化合物2 在正离子模式下确定的分子离子峰，可知化合物2 的准分子离子峰[M+H]+为611.1597m/z 及[M+Na]+633.1414m/z 的分子离子峰，因此化合物2 的分子量为610Da。通过比对图3二级质谱数据断裂碎片，进一步推测化合物裂解途径论证该化合物结构，二级质谱断裂表现为显著的多酚类化合物的电离特征。准分子离子峰[M+H]+(m/z)在断裂1 个葡糖苷（C6H5O10）碎片后，产生分子离子碎片峰[M+H]+449.1066m/z，而后在第二次相继断裂1 个葡糖苷（C6H5O10）碎片，得到分子离子碎片峰[M+H]+287.0543m/z，即最终得到相对分子质量287Da即为山奈酚相对分子质量。结合紫外光谱，化合物2在265nm 和348nm 处有最大吸收峰，符合多酚类紫外吸收特征。为验证我们的猜测，采用内标法进行标准品验证。标准品为山奈酚-3-O-槐二糖苷（Kaempferol 3-O-sophoroside），分子式为C27H30O16，CAS 号为19895-95-5，其纯度为98%以上；鉴定结果与文献报道一致[15-19]。因此，化合物2 最终鉴定为山奈酚-3-O-槐二糖苷。

图3 正离子模式下化合物2的质谱图（LC-QTOF-MS/MS）

2.2 破壁前后油菜蜂花粉中化合物含量测定

以槲皮素-3-O-槐二糖苷为标准品，配制成浓度为200μg/mL 标准液，分别进样10、20、30、40、50μL，平行测定三组，以进样量为X 轴，峰面积为Y 轴绘制标准曲线，结果如表3，其回归方程为Y=838511X-297448，相关系数为R2=0.991，表明槲皮素-3-O-槐二糖苷进样量在0～10μg 范围内线性关系良好，灵敏度较高。

以山奈酚-3-O-槐二糖苷为标准品，配制成浓度 为1.28mg/ml 标准液，分别进样2、6、10、14、18μl，平行测定三组，以进样量为X 轴，峰面积为Y 轴绘制标准曲线，结果如表3，其回归方程为Y=1000000X+105510，相关系数为R2=0.998，表明山奈酚-3-O-槐二糖苷进样量在0～25μg 范围内线性关系良好，灵敏度较高。

表3 标准品线性回归方程和相关系数

结果如表4所示，油菜蜂花粉样品中均检测到槲皮素-3-O-槐二糖苷和山奈酚-3-O-槐二糖苷，其中两种化合物平均值之和达到13.43mg/g，占花粉的1%以上。16 个油菜蜂花粉中黄酮类成分在破壁前槲皮素-3-O-槐二糖苷含量范围为2.96～6.23mg/g，其平均含量为4.26±1.12mg/g。在破壁后，槲皮素-3-O-槐二糖苷含量明显增加，含量范围为6.33～8.27mg/g，其平均值达到7.39mg/g，高出未破壁相应成分3.13mg/g。山奈酚-3-O-槐二糖苷在破壁前含量范围为7.05～13.73mg/g，其平均含量9.17±2.14mg/g。在破壁后，山奈酚-3-O-槐二糖苷含量明显增加，含量范围为10.65～16.30mg/g，其平均值达到13.55mg/g，高出未破壁相应成分4.38mg/g。以上成分含量的变化，进一步说明破壁有利于成分的释放。

表4 不同产地油菜蜂花粉中黄酮类和精胺类化合物含量

3 讨论与结论

本研究采用HPLC-QTOF-MS 法和内标验证法，检测到油菜蜂花粉中黄酮类物质为槲皮素-3-O-槐二糖苷和山奈酚-3-O-槐二糖苷。对两种化合物进行定量分析发现，在破壁后，两种化合物的含量均有所提升。破壁后，槲皮素-3-O-槐二糖苷平均值达到7.39mg/g，含量提高了73.5%，占花粉的0.7%以上。山奈酚-3-O-槐二糖苷平均值达到13.55mg/g，含量提高了47.8%，占花粉的1.3%。杨佳林[20]以油菜蜂花粉为原料，经测定，天然油菜蜂花粉中山奈酚-3--O-(2”-O-β-D-吡喃葡萄糖)-β-D-葡萄糖的含量为0.313%±0.0001。以上成分含量的变化，进一步说明破壁有利于成分的释放。这是首次在油菜蜂花粉中通过高剪切-超声联用技术，对比破壁前后槲皮素-3-O-槐二糖苷和山奈酚-3-O-槐二糖苷的含量变化。这两种化合物有多种生物功能，具有降血脂、抗氧化、降低胆固醇、抗炎等[21,22]功效。研究表明油菜蜂花粉中的黄酮类化合物对羟基自由基有较好的清除率，在25～100mg/ml 的范围里浓度与清除率呈线性关系[23]。此外，定量分析结果还为后期黄酮类成分的生物学活性及其药理学作用的研究提供了物质基础。