月桂酰精氨酸乙酯对牦牛鲜肉肠贮藏期间品质的影响

彭美玲，郝刚，唐善虎，李思宁

(西南民族大学 食品科学与技术学院，四川 成都，610041)

被誉为 “高原之舟”的牦牛，生活在高海拔地带，是高原牧区的主要家畜之一，大都生活在我国青藏高原。它极其耐寒，适应高海拔、低氧的气候环境，因而牦牛肉不同于其他品种的牛肉[1]。牦牛肉味道鲜美、高蛋白、低脂、富含多种氨基酸，是极富营养且高经济价值的天然绿色肉食品[2]。

壳聚糖(chitosan，CS)与乳酸链球菌素(Nisin)是常用的食品保鲜剂，肉制品中添加Nisin可以使肉肠的色泽更加鲜艳[3]。壳聚糖复合抗菌膜对贮藏过程中冷鲜肉的挥发性盐基氮、感官等指标有影响，能够有显著延缓冷鲜肉的腐败[4-5]。壳聚糖涂层也能很好地抑制冷冻鱼的变质[6-7]。壳聚糖复合膜包装猪肉肠贮藏于4 ℃条件下，肉肠的颜色，质地、脂质氧化等方面的变化均低于对照组(未添加壳聚糖)[8]。徐畅等[9]研究发现壳聚糖复合保鲜能够改善冷鲜猪肉的感官品质，降低汁液流失率，并抑制微生物生长。Nisin处理冷鲜羊肉的保鲜在4 ℃下的货架期可从6 d 延长至18 d[10]。侯晓卫等[11]研究发现Nisin能抑制冷鲜牦牛肉贮藏过程中菌落总数、挥发性盐基氮的增长。乳酸链球菌素能有效抑制单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌[12]。杨雯舸等[13]研究了Nisin与植物乳酸杆菌素的复合膜对冷鲜猪肉保鲜时间可延长4 d。乳酸链球菌素复合其他保鲜剂可有效提高肉制品的安全性，抑制腐败微生物生长[14-16]。

月桂酰精氨酸乙酯(lauroyl giycine ethyl ester，LAE)是一种新型食品保鲜剂，对许多食源性病原菌有较高的抑制性能[17]。LAE早在2005年已被FDA批准为一般公认安全(GRAS)食品添加剂，2012年澳大利亚食品标准局发布134号食品标准修订公告，批准将LAE作为食品保鲜剂使用于香肠与香肠肉中，规定最大使用量为315 mg/kg[18]。有文献报道LAE可应用于乳制品、果蔬和肉制品[19-21]保鲜，李阳等[22]研究了LAE对果蔬腐败菌的抑菌性能，包括意大利青霉、指状青霉、链格孢和灰葡萄孢，并测定了LAE对4种菌的最小抑菌浓度分别为400、400、200、400 μg/mL。研究者测定LAE对2株大肠杆菌0157∶H7的抗菌性，证明含有26%LAE的薄膜包装对绵羊奶酪中细菌的数量有影响[23]。研究者将LAE制成薄膜用于即食食品保鲜，对大肠杆菌有显著的抑制作用[24]。但将LAE与其他保鲜剂复配的研究较少，壳聚糖与Nisin是安全性高、抑菌性强、生物相容性好抑菌保鲜剂，LAE与上述2种抑菌剂复配能显著提高保鲜能力。牦牛肉肠具有高品质、高营养的特点，但在贮藏过程中容易滋生细菌而影响其品质。本试验研究了单独使用LAE 以及将LAE与壳聚糖、Nisin复配应用于牦牛鲜肉肠中，探究其对牦牛鲜肉肠贮藏期间品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：牦牛肉(背最长肌)，四川红原牦牛肉食品责任有限公司；猪肠衣、肥猪膘，成都农贸市场；月桂酰精氨酸乙酯，BR 成都傲飞生物化学品责任有限公司；壳聚糖(食品级)，深圳市星牧生物工程有限公司；Nisin(食品级)，山东元泰生物工程有限公司。

辅料：食盐、五香粉、料酒、鸡精，成都农贸市场。

主要试剂：氧化镁、硼酸、盐酸、甲基红指示剂、无水乙醇，均为分析纯，成都科龙化工试剂厂。

试验仪器：BSA224S-CW型电子天平，赛多利斯仪器有限公司；PHS-320型 pH计，成都世纪方舟科技有限公司；XR53648型电热恒温水浴锅，金坛区西城新瑞有限公司；5810R型台式冷冻离心机，德国Eppendorf公司。

1.2 试验方法

1.2.1 牦牛肉肠制作工艺

牦牛鲜肉肠工艺流程：原料肉→修整切块→混料拌匀→腌制→绞肉→灌肠→结扎排气→成品。具体流程：精选优质牦牛肉和猪肥膘，清洗后修整除去筋膜、筋腱，切成约2 cm×2 cm×2 cm的块状，沥干表面水分，将原料[m(猪肥膘)∶m(牦牛肉)=3∶7]、辅料(原料以100%计，食盐3.5%，五香粉0.5%，鸡精0.4%，料酒1.0%，均为质量分数)混合均匀，置于4 ℃冰箱腌制24 h，当肉呈现均匀鲜红色、手触有质感、滑腻感，完成腌制，分别将LAE保鲜组分混入腌制完毕的牦牛肉中搅碎，灌装成长度为5～8 cm 的肠体，用排气针扎眼排除肠内气体后放置于0～4 ℃冰箱低温贮藏，于第0、3、6、9、12、15天测定指标。各处理组如下：

(1)对照组：不添加任何保鲜剂，仅以牦牛肉与猪肥膘为主原料，添加辅料混匀后灌肠。

(2)低浓度LAE组：LAE的添加量为0.1 g/kg，并以牦牛肉与猪肥膘为主原料，添加辅料混匀后灌肠。

(3)高浓度LAE组：LAE的添加量为0.3 g/kg，并以牦牛肉与猪肥膘为主原料，添加辅料混匀后灌肠。

(4)LAE与Nisin复配组：LAE(0.2 g/kg)+Nisin(0.3 g/kg)，并以牦牛肉与猪肥膘为主原料，添加辅料混匀后灌肠。

(5)LAE与CS复配组：LAE(0.2 g/kg)+CS(5 g/kg)，并以牦牛肉与猪肥膘为主原料，添加辅料混匀后灌肠。

(6)LAE、Nisin与CS复配组：LAE(0.2 g/kg)+Nisin(0.3 g/kg)+CS(5 g/kg)，并以牦牛肉与猪肥膘为主原料，添加辅料混匀后灌肠。

1.2.2 汁液流失率测定

参考李儒仁等[25]的方法，于各测定时间点取出牦牛鲜肉肠，迅速将试样表面的汁液用滤纸吸干称重(记为M2)，贮藏前试样的质量为M1，从而计算其失水率，每个样品重复3次取平均值。计算如公式(1)所示：

(1)

式中：M1为贮藏前试样的质量；M2为贮藏后试样的质量。

1.2.3 pH测定

取搅碎的牦牛鲜肉肠样品5 g置于小烧杯内，加入50 mL蒸馏水混合，室温静置15 min左右过滤，将酸度计的玻璃电极插入滤液内，并在酸度计表头上读出其pH值。分别在第0、3、6、9、12、15天测其pH值，每个样品重复3次取平均值。

1.2.4 蒸煮损失

将牦牛鲜肉肠切成约5 g(M1)，用样品袋装好，将袋中气体挤出，放入水浴锅85 ℃加热10 min，取出冲水冷却10 min至室温，再次称重，计为M2，计算如公式(2)所示：

(2)

1.2.5 挥发性盐基氮测定

采用自动凯氏定氮仪法测定牦牛鲜肉肠中挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)[26]。

1.2.6 感官评价

牦牛鲜肉肠在沸水中煮熟取出后，晾5 min，用刀将其切成3 mm左右的片状，邀请10位有一定感官品评经验的人，分别从外观、色泽、香气、质地4个方面进行肉肠感官评价，详见表1。

表1 牦牛鲜肉肠的感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of yak sausage

1.2.7 抗菌活性的评估

1.2.7.1 菌落总数的测定

按照国标GB 4789.2—2016测定牦牛鲜肉肠中菌落总数[27]。

1.2.7.2 CFU-time关系模型

CFU-time关系变化逻辑函数可提供良好评估LAE及与其他保鲜剂复配在肉肠中的抑菌效果的模型(图1)，计算见公式(3)：

(3)

式中：CFU(t)为细菌达到最大生长速度的菌落数；CFUasym为渐近CFU值(由于对照组在15 d贮藏期内菌落生长没有达到固定值，即生长曲线调整值)；k为生长曲线在拐点处(即生长速率最大值)的斜率，tc为添加LAE应用生长曲线拐点的位置；t为对照组生长曲线拐点的位置。

1.3 数据处理与统计分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据统计、IBM SPSS Statistics 20软件进行统计分析，差异显著用P<0.05表示。

2 结果与分析

2.1 不同LAE处理组对牦牛鲜肉肠贮藏期间汁液流失率的影响

牦牛鲜肉肠贮藏期间汁液流失率如表2所示，在整个贮藏期15 d内，对照组与保鲜组的汁液流失率都呈显著增大的趋势(P<0.05)。低浓度LAE组与高浓度LAE组的增加趋势小于对照组，且低浓度LAE的汁液流失率大于高浓度LAE。LAE+Nisin和LAE+CS组汁液流失率低于对照组与低浓度LAE组，且LAE+CS远小于高浓度LAE与低浓度LAE组，但LAE+Nisin却略大于高浓度LAE，说明LAE+CS在一定时间内能显著降低牦牛肉肠的汁液流失率，而LAE+Nisin复配阻止汁液流失的效果并不明显。对照组第15天汁液流失最为严重，为1.679%，LAE+Nisin+CS在贮藏期间表现出较小的汁液流失率。由于添加保鲜剂后抑制细菌生长，从而细菌分泌的蛋白酶少，被水解的蛋白少，肌肉的凝胶结构就能保持，从而留住水分；另一方面，腐败菌被抑制后，牦牛肉肠的pH变化不大，蛋白质净电荷变化就不大[28]，蛋白质持水力变化也不大，因此能较好地留住水分，而LAE+CS和LAE+Nisin+CS的汁液流失率远小于组其他处理组，可能是因为壳聚糖具有保水性,能够使保水能力得到进一步加强[29]。

表2 牦牛鲜肉肠贮藏期间汁液流失率的变化Table 2 Changes of juice leakage during storage of yak sausage

2.2 不同LAE处理组对牦牛鲜肉肠贮藏期间pH值的影响

牦牛鲜肉肠中细菌生长与肉的pH值有直接关系，当肉的pH值在6.0或者小于6.0时，会抑制细菌的繁殖，肉中蛋白质分解程度相对较小，肉质新鲜。但随贮藏时间延长，细菌生长繁殖速度加快，导致蛋白质分解，氨及胺类等物质大量蓄积，导致pH值增加，达到6.7或高于6.7，此时肉已腐败变质[9]。

贮藏期间牦牛肉肠的pH值变化如表3所示，肉肠在贮藏过程中pH值总体呈增大的趋势，对照组在15 d内各测量时间点的pH值变化差异显著(P<0.05)。低浓度LAE和高浓度LAE组除了在第0天和第9天时差异不显著，其他时间点的pH值变化差异显著(P<0.05)，说明不同LAE浓度在一定时间内对牦牛肉贮藏期pH变化有影响，且高浓度LAE保鲜效果优于低浓度LAE。低浓度LAE、高浓度LAE与LAE+Nisin、LAE+CS在贮藏期内pH值变化差异显著(P<0.05)，说明LAE复合保鲜效果优于单一LAE处理组，LAE+Nisin和LAE+CS在3 d后pH值变化差异不显著(P>0.05)，证明LAE+Nisin和LAE+CS对pH值变化影响相当。LAE+Nisin+CS组在前9 d pH值增大差异不显著，第9天后增大趋势显著，说明3种保鲜剂复配在一定时间内具有良好保鲜效果。到第15天时对照组的pH值最大，其次是LAE低、高浓度组，再次为LAE+Nisin、LAE+CS复配组，而3种保鲜剂复配时pH值最小，为6.22，说明以上3种保鲜剂复配能显著抑制细菌的生长对pH值带来的影响。

2.3 不同LAE处理组对牦牛鲜肉肠贮藏期间蒸煮损失的影响

在贮藏过程中，随时间的延长，牦牛鲜肉肠纤维中的蛋白质由于微生物生长导致蛋白质被细菌酶分解，肉中蛋白质三维网状凝胶结构遭到破坏，影响其锁水能力，另外，灌肠类食品属乳化体系，在贮藏和蒸煮过程中容易出水出油[30]，因此在蒸煮过程中会造成一定耗损。牦牛鲜肉肠贮藏期间的蒸煮损失如表4所示，对照组与保鲜组的蒸煮损失均呈现逐渐增大的趋势(P<0.05)。但总体而言，第15天对照组蒸煮损失最大，为44.86%。低浓度LAE、高浓度LAE、LAE+Nisin的蒸煮损失小于对照组，且相差不大，证明添加LAE或其与Nisin复配在一定程度上可减少蒸煮损失，LAE+CS又优于LAE+Nisin，表明LAE+CS的复配效果优于LAE+Nisin，总体而言，LAE+Nisin+CS在第15天时的蒸煮损失最小，可能是由于LAE复合保鲜剂的抑菌和抑酶作用，一定程度上可缓减由微生物引起肌肉蛋白降解及组织特性被破坏，另外壳聚糖具有成膜性，可阻碍肉肠各成分的散失，也有助于减少损失[28]。

表4 牦牛鲜肉肠贮藏期间蒸煮损失的变化Table 4 Changes of cooking loss of yak sausage during storage

2.4 不同LAE处理组对牦牛鲜肉肠贮藏期间感官的影响

牦牛鲜肉肠在贮藏过程中，受微生物污染以及内部自身酶的作用，肉肠品质逐渐下降，切面无光泽并伴有异味。牦牛鲜肉肠感官变化如表5所示，各个组在贮藏期内的感官评分均为降低的趋势(P<0.05)，对照组下降的趋势最为显著，低浓度LAE和高浓度LAE在3 d后的评分均高于对照组，且高浓度LAE高于低浓度LAE，证明LAE高浓度有利于抑制腐败，提高其感官评分，组LAE+Nisin、LAE+CS在第15天的评分高于高浓度LAE组，则证明通过复配后保鲜效果更好，且LAE+CS优于LAE+Nisin。LAE+Nisin+CS在各时间点的评分相对最高，通过3种保鲜剂复配后抑制微生物生长的能力最强，显著延缓了肉肠腐败变质，在第15天时还有芳香味。

表5 牦牛鲜肉肠贮藏期间感官的影响Table 5 Sensory effects of yak sausage during storage

2.5 不同LAE处理组对牦牛鲜肉肠贮藏期间TVB-N的影响

TVB-N常作为衡量肉腐败的重要指标。牦牛鲜肉肠在贮藏过程中，随时间延长，由于肉内的内源性酶和微生物作用，少量蛋白质降解生成微量的胺类物质[31]。由图2可知，对照组与保鲜处理组在贮藏15 d内的TVB-N均呈现显著增长的趋势(P<0.05)，其中对照组的增长趋势最为显著(P<0.05)，在第9天时达到(20.1±0.266) mg/100g，此时肉肠已腐败变质，添加 LAE相比于对照组能抑制TVB-N增长，且其抑制程度与LAE浓度有关，浓度越大抑制作用越强，LAE与Nisin和CS复合保鲜的抑制效果强于单一LAE作用，2组复配效果相当。当3种保鲜剂复合使用时，其抑制效果最好，到第15天时，其TVB-N值为(16.5±0.368) mg/100g，这一结果与菌落总数结果相一致。因此，相比于对照组，在牦牛肉肠中添加LAE复合保鲜剂具有良好的保鲜效果。

2.6 不同LAE处理组对牦牛鲜肉肠贮藏期间菌落总数的影响

根据肉质腐败变质的评价标准，以菌落总数计：一级鲜肉(0～104CFU/g)、次级鲜肉(104～106CFU/g)、腐败变质肉大于106CFU/g。牦牛鲜肉肠贮藏过程中菌落总数变化如图3所示，所有组别在贮藏期间菌落总数都显著增加(P<0.05)，其中对照组增大的趋势最显著(P<0.05)，其在第6天后开始逐渐腐败变质，其次是低浓度LAE组，再次是高浓度LAE组，LAE+Nisin与LAE+CS的抑菌效果优于高浓度LAE组，LAE+Nisin和LAE+CS复配组对牦牛鲜肉肠的抑菌效果相差不大。到第15天时，除了对照组与低浓度LAE组，其他处理组均为次级鲜肉，且在第15天时LAE+Nisin+CS组菌落总数增加量最小，为4.20 lgCFU/g，接近一级鲜肉标准。说明LAE能显著抑制肉肠中腐败菌的生长，且随浓度增大抑菌效果越强，复配后保鲜效果强于LAE单一保鲜效果，3种保鲜剂复配能有效抑制肉肠中腐败菌的生长，保鲜效果最显著。

2.7 不同LAE保鲜组抗菌活性评估

CFU-time关系变化逻辑函数模型衡量了由于保鲜剂的加入导致细菌生长延迟，可量化评估保鲜剂在肉肠中的抑菌活性。通过此模型，可比较各保鲜组生长曲线拐点相对于对照组延长的时间，即Δtc(d)。生长曲线的斜率即是细菌生长速率，随着贮藏期的延长，生长速率逐渐增大至最大值，即拐点处的斜率，此后生长速率逐渐降低。Δtc=(tc对照-tc不同保鲜组)，所有模型R2≥0.916。Δtc(d)越大则该保鲜配方的抑菌活性越高，结果如表6所示。

表6 不同处理组Δtc值Table 6 Different Δtc value of the treatment group

由表6可看出，不同LAE保鲜组合推迟细菌生长速率达到最大值的活性如下：LAE(低浓度)

由表6可知，在肉肠中加入LAE能够显著延长Δtc，因LAE具有表面活性，且带正电，可通过与带相反电荷的蛋白质或酶反应从而破坏腐败微生物的细胞膜，抑制其生长，LAE与其他保鲜剂复合使用更能延长Δtc，LAE+Nisin+CS复配的Δtc最大，能推迟细菌达最大生长速率时间至9.1 d，其抑菌效果最显著。

3 结论

本试验中，各处理组对牦牛鲜肉肠的总体保鲜能力大小为：LAE+Nisin+CS>LAE+CS>LAE+Nisin>LAE(高浓度)>LAE(低浓度) >对照。复合保鲜剂保鲜效果显著，在15 d贮藏期能降低蒸煮损失及汁液流失率，抑制腐败菌的生长，延长腐败菌达到最大生长速度的时间Δtc，保持良好感官品质。综上，LAE通过与CS或Nisin复配能有效提高牦牛鲜肉肠的保鲜能力，延长货架期，这可为牦牛鲜肉肠复合保鲜剂的开发、生产应用提供新方向。