眉县猕猴桃果品氯吡脲残留量测定

李海亮，李浩浩，魏倩倩

(眉县食品安全检验检测中心，陕西 眉县 722301)

眉县是我国猕猴桃主产区之一，也是“国家地理标志产品”“国家生态原产地保护产品”县。近年来，随着栽植面积和市场对优质产品需求量的大幅增加，猕猴桃生产与销售面临产品质量控制难，产品销售市场竞争激烈，产业链需全程科学、规范、高效管理等问题[1]。

氯吡脲(Forchlorfenuron)是一种人工合成的细胞分裂素，具有促进细胞分裂、分化和增大，促进花芽发育，防止落花落果，提高果实坐果率和促进果实膨大等功效，是目前使用最广泛的植物生长调节剂之一。近年来一些猕猴桃果实生理和品质研究表明，氯吡脲对猕猴桃果品的口感和品质有一定影响，引起了人们关注。目前氯吡脲检测国家标准主要2个，一是GB/T 20770-2008《粮谷中486种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱——串联质谱法》，规定了检测486种农药及相关化学品的方法，为规避杂质对多种检测目标物的干扰，前处理过程较为复杂；二是GB 23200.110-2018《植物源性食品中氯吡脲残留量的测定 液相色谱——质谱联用法》，针对植物源性产品专门检测氯吡脲，提取液要经过无水硫酸镁和PSA净化，前处理过程也较为复杂，对此有人对西瓜[4]、蔬菜[5-6]氯吡脲检测的样品净化方法作了有益尝试并取得较好效果。迄今猕猴桃果品氯吡脲检测国内尚无简便、可靠方法，为此我们进行了检测方法优化，并采用新确立的方法对眉县猕猴桃氯吡脲残留量进行了检测。

1 材料和方法

1.1 氯吡脲测定方法的确定

1.1.1 仪器与试剂 主要有高效液相色谱仪串联三级四重杆质谱仪、高速冷冻离心机、超声提取仪；氯吡脲标准品(浓度100 μg·ml-1，农业部环境保护科研检测所)、甲醇、乙腈、一级水、C18填料、PSA填料、氯化钠、无水硫酸镁、0.22 μm有机滤膜。

标样溶液配制：称取一定量的氯吡脲标准品，用甲醇配制成8 μg·ml-1的标样储备液，储存于0～4 ℃的条件下，根据需要用甲醇稀释至适当浓度的标样溶液。

1.1.2 仪器参数

(1)色谱条件

色谱柱：C18 柱(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流动相A：水；流动相B：甲醇；流动相C：0.1%甲酸水；流动相D：乙腈；流速：0.25 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。梯度程序如表1。

表1 流动相梯度程序

(2)质谱条件

正、负离子模式下氯吡脲均有较强响应，15 ng·ml-1氯吡脲标准品在设定条件下正离子响应为1.04×106；负离子模式响应为5.48×105。通过实验，负离子模式下存在杂质干扰，检测值不稳定且加标回收率偏小；而正离子模式下回收率和精密度均符合要求，故选择正离子模式。正离子模式条件为：碰撞气为氮气；电喷雾电压为3 200 V；离子传输管温度320 ℃；离子源温度350 ℃；辅助气压力5Arb；SRM模式下的参数见表2。

表2 正离子模式下的质谱参数

1.1.3 样品前处理 称取均质样品5.0 g放入50 mL塑料离心管内，加入10 mL乙腈(分析纯)涡旋提取2 min，超声5 min，以6 000 r/min离心5 min，取上清液到另一离心管中备用；再用10 mL乙腈试剂对原样品残渣涡旋提取一次，离心取全部上清液与第一步的提取液合并，向合并后的提取液中加入2 g氯化钠，涡旋混匀，离心后取适量上层提取液，过0.22 μm有机滤膜，供液相色谱—串联质谱测定。

1.2 猕猴桃果品氯吡脲含量测定

1.2.1 样品采集 在全县范围内选取栽植面积大而集中，管理技术水平具有代表性的乡镇，再在所选乡镇选取有代表性的田块，并在其中随机选取生长正常的植株5个并编号挂牌(样株)，在每个样株不同方位选取基本等量的果品。样品采集时间为植物生长调节剂处理后第80、90、100 d，每次采集时每个样株选取的果品按株混合、及时预处理和妥善保存。

1.2.2 测定方法 按2.1 氯吡脲确定的测定方法测定。

2 结果与分析

2.1 样品提取和净化

2.1.1 溶剂乙腈量的选择 采用提取率较高的乙腈提取法，在猕猴桃阴性样品中添加一定量(20 μg·kg-1)氯吡脲标准溶液,10 ml乙腈一次提取、20 ml乙腈一次提取、20 ml乙腈二次提取，回收率分别为90.5%、93.7%和95.4%，表明使用20 ml乙腈分二次提取更充分。

2.1.2 除杂过程的选择 经对猕猴桃阴性样品进行50 μg·kg-1水平氯吡脲加标(限量值加标)，收集二次10 ml乙腈提取液混匀，取3 ml加入到各实验组对应的除杂试剂中(同时做不除杂对照)，涡旋离心后取上清液检测，取得的不同除杂试剂回收率结果如表3。

从表3可看出，猕猴桃样品经过乙腈提取后，提取液中会含有来自于猕猴桃样品中的水分，这部分水分会对提取液产生稀释作用，从而导致加标回收率偏低。而采用氯化钠、无水硫酸镁或无水硫酸钠除水后的提取液避免了水分对样品的稀释，从而实验回收率趋于正常。不除杂的对照实验中，上机检测出峰位置并无杂质干扰，只是回收率处于较低水平；单纯使用氯化钠除水后的样品，检测结果同样无杂质干扰，且回收率较为理想。与使用氯化钠除水相比，使用无水硫酸镁和无水硫酸钠除水时，使用前需要对试剂烘干，且成本高于氯化钠，故本研究确定单独使用氯化钠分离样品中水分的方法。在猕猴桃称样量5.0 g、20 ml乙腈提取的条件下，2 g氯化钠即可在猕猴桃样品所含的水分中达到饱和并析出，从而与乙腈分层，所以本方法最终确定了 “2.1.3样品前处理”中的提取方法。

图1 空白基质中添加氯吡脲标样溶液的选择粒子总流图(20 μg·ml-1)

表3 不同除杂试剂的氯吡脲加标回收率

2.2 线性方程及检出限

通过配置不同浓度梯度的氯吡脲标准品(0.08～30 ng·ml-1)检测，以浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，得到线性归方程为：Y=0.218 6×106x+0.527×105，R2=0.999 6，线性良好。以3倍信噪比(S/N=3)所对应的标样溶液质量分数为仪器的最低检测浓度，再根据样品的稀释倍数(20倍)，确定本法的最低检出限为0.4 μg·kg-1。

2.3 测定方法的准确度和精确度

在猕猴桃氯吡脲阴性样品中添加浓度分别为0.4、10、100 μg·kg-1时，测定计算结果显示，本方法回收率为85%～107%，相对标准偏差1.26%～5.47%(表4)。试验回收率和相对标准偏差均满足GB/T27404-2008要求。该方法最低检出限为0.4 μg·kg-1。

图2 氯吡脲标准曲线

2.4 猕猴桃氯吡脲测定方法的可行性

对比美国环境保护局对大部分水果规定的氯吡脲最大残留量0.01 mg·kg-1，我国GB 2763-2019食品安全国家标准规定的猕猴桃(食品)氯吡脲最大残留限量0.05 mg·kg-1，和本实验猕猴桃4个品种(徐香、红阳、海沃德、秦美)的阴性样品不同浓度氯吡脲加标实验结果(表4)及最低检出限0.4 μg·kg-1，表明本方法能满足猕猴桃果品氯吡脲残留分析要求，完全适用于猕猴桃氯吡脲残留分析。

表4 实验回收率和精确度

2.5 眉县猕猴桃中氯吡脲残留量

表5显示，眉县猕猴桃主栽区和主要栽植品种在浸蘸植物生长调节剂80 d后即8月上旬前后果品氯吡脲残留量0.025～0.058 mg·kg-1，其中徐香品种既有最高值也有最低值，小法仪镇测定的2个品种含量都较高，浸蘸植物生长调节剂90 d、100 d氯吡脲残留量高低也呈现同样趋势，表明猕猴桃果品氯吡脲残留量高低与品种没有必然联系，可能与栽植区域即地形地势和小气候有关。

表5 眉县猕猴桃果品氯吡脲含量

所测定的全部样品氯吡脲残留量从浸蘸植物生长调节剂80 d后的0.025～0.058 mg·kg-1、平均0.039 mg·kg-1，降低到90 d后(8月中旬)的0.008～0.033 mg·kg-1、平均0.018 mg·kg-1，降幅为40.4%～68.0%、平均55.0%；又从90 d后降低到100 d后(8月下旬)的0.002～0.016 mg·kg-1、平均0.006 mg·kg-1，降幅为51.5%～75.0%、平均68.1%；表明随着生长，果品的氯吡脲残留量逐步降低，且随时间延长降低幅度加大，原因可能有二，一是药物自身的代谢衰减，二是生长后期猕猴桃果实进一步增重，对药物残留浓度起到了稀释作用。

所测定的全部样品氯吡脲残留量在蘸植物生长调节剂90 d、100 d后都低于我国标准(0.05 mg·kg-1)，且分别只有国家标准值的16.0%～66.0%(平均36.3%)、4.0%～32.0%(平均12.5%)，即使是残留量较高的蘸植物生长调节剂80 d也只有1个样品高于我国标准，说明眉县猕猴桃果品氯吡脲残留量在8月中旬以后合格、安全。

3 结论与讨论

(1)本研究确定的猕猴桃果品氯吡脲残留量测定方法步骤为：称取均质样品5.0 g放入50 ml塑料离心管内，加入10 ml乙腈(分析纯)涡旋提取2 min，超声5 min，以6 000 r·min-1离心5 min，取上清液到另一离心管中备用；再用10 ml乙腈试剂对原样品残渣涡旋提取一次，离心取全部上清液与第一步的提取液合并，向合并后的提取液中加入2 g氯化钠，涡旋混匀，离心后取适量上层提取液，过0.22 μm有机滤膜，供液相色谱—串联质谱测定。

(2)眉县猕猴桃果品浸蘸氯吡脲类植物生长调节剂80、90、100 d后，氯吡脲残留量依次为0.025～0.058、0.008～0.033、0.002～0.016 mg·kg-1，除80 d后1个样品高于国家标准外，其余批次均符合国家标准要求，食用安全，尤其是施药后100 d的残留量非常低，仅为国家标准(0.05 mg·kg-1)的4.0%～32.0%(平均12.5%)。

(3)相关研究表明[13], 猕猴桃中氯吡脲的代谢消解符合非线性一级动力学消解模式，浸蘸后27 d之内残留量急剧下降，消解率达到60%～80%,不同生长时期对消解率有显著影响，不同施药浓度、不同品种对消解率影响不显著。眉县猕猴桃生产中绝大多数农户只在5月中旬(开花后30～40 d)、严格按药品使用说明对幼果浸蘸氯吡脲类植物生长调节剂，同时2020年眉县政府有关部门规定并监督检查“8月25日之前禁止采摘销售，8月25日之后分品种视成熟情况采摘”,可确保猕猴桃幼果浸蘸氯吡脲类植物生长调节剂后有100 d以上的生长期，并完全达到国家规定的氯吡脲残留量安全标准。目前市场上可用于猕猴桃生产的氯吡脲类植物生长调节剂合格产品，对提高产量、改善商品性、促进果农增收等作用明显，科学使用氯吡脲类植物生长调节剂不失为一种高效安全的方式。