参麦注射液治疗膝关节骨关节炎的网络药理学分析及临床对照验证

程中午 王大玉 张本结 周杰 杜辉

膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA) 是一种年龄相关性退行性疾病，以关节软骨退变和滑膜炎症为特征[1]，表现为膝关节疼痛、僵硬和功能障碍及慢性骨关节炎导致骨赘形成、关节间隙变形和狭窄[2]，其降低患者生活质量，增加社会经济和医疗负担。虽然 KOA 机制尚不清楚，但已知与年龄、肥胖、创伤、炎症、遗传易感性等机械和生物学因素对软骨细胞内分解代谢和合成代谢有关[3-4]。早期 KOA 一般采取保守治疗，主要有非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs) 和氨基葡萄糖类口服药，以及透明质酸钠注射液和富血小板血浆等关节腔内注射疗法[5-6]。参麦注射液(shenmai injection，SMI) 关节腔内注射治疗 KOA 可以改善膝关节功能，减轻关节疼痛[8]。然而，其治疗 KOA 的潜在药理作用机制尚不清楚，其成分及关键靶点的药效学特性也不清楚。

网络药理学将化学信息学、生物信息学和网络生物学相结合，能够揭示复杂的药理机制。因此，本研究将网络药理学与临床对照试验相结合，以阐明 SMI 关节腔内注射治疗 KOA 的物质基础及分子 机制。

材料与方法

一、网络药理学方法

1.SMI 化学成分筛选及作用靶标筛选：通过 TCMSP 数据库检索获取红参化学成分和靶点，过滤标准：口服生物利用度(oral bioavailability，OB) ≥ 30%、药物相似性(drug-likeness，DL) ≥ 0.18。通过 BATMAN-TCM 数据库获取麦冬化学成分和靶点，通过设置P< 0.05，潜在分数截断值 30。共获得 18 个化学成分，147 个靶点。其中红参 4 个化学成分，靶点 24 个；麦冬 14 个化学成分；靶点 123 个。去除重复靶标后获得 106 个靶点。

2.KOA 相关靶基因搜集及筛选：从 GeneCard、OMIN 数据库检索 KOA 相关靶基因。去除假阳性靶基因和重复靶基因后共获得 2064 个靶基因。将 106 个 SMI 靶点映射到 2064 个 KOA 靶基因中，得到 25 个 SMI 抗 KOA 关键靶点。根据 25 个关键靶点得出红参治疗 KOA 中有 2 个有效化学成分，麦冬治疗 KOA 中有 5 个有效化学成分。

3.蛋白相互作用(protein-protein interaction， PPI) 网络的构建与分析：将 25 个关键靶点导入 String 数据库中并构建 PPI 网络[9]。

4.拓扑分析与复合目标网络构建：在 PPI 网络中导出 TSV 数据，使用 Cytoscape 软件和 CytoNCA 软件进行分析。通过 Betweenness(BC)、Closeness(CC)、Degree(DC)、Eigenvector、Local Average Connectivity(LAC) 和 Network(NC) 对复合目标网络进行拓扑分析，过滤关键靶点，获取核心关键靶点。过滤条件设置为同时满足 BC、CC、DC、EC、LAC 和 NC 的中位值。

Cytoscape 软件能将药物治疗疾病的有效化学成分及作用机制进行可视化分析[10]。将 7 个有效活性成分及 25 个关键靶点导入 Cytoscape 软件构建 SMI-关键靶点-KOA 复合目标网络并实现可视化。在复合目标网络中，其节点表示化合物、疾病或靶蛋白，其中边表示节点分子之间得相互关系。

5.基因本体论(gene ontology，GO) 生物功能分析和基因及基因组的京都百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路富集分析：对 25 个关键靶点进行 GO 生物功能分析及 KEGG 通路富集分析。阈值设定为P≤ 0.05，并绘制柱状图。

6.分子对接技术分析：在 PubChem 数据库中下载小分子配体 2D 结构文件，采用 Chem 3D 软件进行最小自由能设置并转化为 3D 结构文件。从 RCSB PBD 数据库中下载基因的 PBD 格式，采用 AutoDockTools-1.5.6 加氢处理，将活性口袋设置 为 1，寻找核心靶基因活性位点或初步确定坐标。采用 AutoDock Vina 进行分子对接。利用 PyMOL 软件绘制分子对接图。

二、临床对照试验

1.一般资料与方法：选取 2017年5月至 2019年11月在我院治疗的 KOA 患者。纳入标准：( 1) 符合 KOA 诊断标准[11]；( 2) 症状性 KOA，存在日常生活活动困难，100 分的疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale，VAS) ≥ 40 分；( 3) 影像学分级 Ⅱ～Ⅳ 级骨关节炎；( 4) 无硫酸氨基葡萄糖、SMI 过敏史；( 5) 签署知情同意书，自愿参加研究项目，愿意接受随访者。排除标准：( 1) 6 个月内无膝关节创伤或手术史；( 2) 6 个月内，关节镜检查或膝关节开放手术、关节内注射透明质酸及类固醇，2 周内服用全身类固醇；( 3) 其它膝关节疾病如感染性关节炎、髌骨软骨病、风湿性关节炎或类风湿因子阳性等；( 4) 计划或预期 1 年内进行膝关节手术治疗；计划进行注射的膝关节皮肤损伤、开放性伤口；( 5) 精神类药物或酒精依赖史；( 6) 血小板 < 100×109/ L；( 7) 妊娠及母乳喂养；( 8) 精神障碍或严重疾病及并发症，如不可控制的糖尿病、高血压或严重肝肾疾病等。最终纳入 120例 KOA 患者。根据随机数字表法分为观察组(n= 65) 及对照组(n= 65)。两组患者临床资料比较差异无统计学意义(P> 0.05)(表1)。本研究患者均签署知情同意书且获得医院伦理委员会批准通过。

表1 两组患者临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups

2.方法：如果患者双膝均存在 KOA，依据较严重一侧进行治疗。观察组：SMI 膝关节腔内注射治疗。由 1 名高年资医师在超声引导下进行膝关节腔内注射。取 SMI 4 ml 和 2% 利多卡因注射液 1 ml 混合液，采用 10 ml 针头，在无菌条件下膝关节外侧经髌上入路缓慢注射。在注射过程中，患者膝关节保持在约 20° 的轻微弯曲位置。每次 5 ml，1 次 / 周，连续治疗 6 周为 1 个疗程。疗程结束后 6 个月进行第 2 个疗程。对照组：透明质酸钠注射液膝关节腔内注射治疗与观察组注射操作过程一致，2 ml / 次，1 次 / 周，连续治疗 6 周为 1 个疗程。疗程结束后 6 个月进行第 2 个治疗疗程。注射后，要求患者限制使用患侧膝关节至少 24 h，并对患处使用冷疗法或冰敷以减轻疼痛。治疗后禁止使用非甾体类药物，允许研究期间患者口服对乙酰胺基酚(扑热息痛，最大 3 g / 天)。在允许情况下，可以逐步恢复正常体育或娱乐活动。

3.数据收集及疗效评估：收集注射前患者的年龄、性别、体质量指数(body mass index，BMI)、患侧膝关节疼痛时间(以注射部位为准)、折射部位、影像学检查分级、VAS 评分、McMaster 大学骨关节炎指数(the western ontario and McMaster universities，WOMAC)、健康调查简表(the MOS item short from health survey，SF-36)。采用 WOMAC、SF-36 评估两组患者治疗后 6 周、12 周、6 个月及 12 个月后效果及生活质量。其中，治疗后 6 个月的 WOMAC、SF-36 数据收集时在即将进行第 2 个治疗疗程前。WOMAC 是根据患者相关症状及体征评估其关节炎严重程度及其治疗疗效，该量表分为疼痛(5 个项目)、僵硬(2 个项目) 及关节功能(17 个项目)[12]，分数越高表示相关症状及体征越严重。SF-36[13]有 36 项评估条目，共 8 个评价项目，分为两个维度：躯体健康(生理功能 + 躯体疼痛 + 总健康状况) 及精神健康(活力 + 社会功能 + 情感职能 + 精神健康)。每个项目满分 100 分，维度分数为 4 个项目得分总和的均值，分数越高表示生活质量越好。

三、统计学处理

采用 SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计数资料用百分率(%) 表示，组间比较采用χ2检验。计量资料以x-±s表示，采用独立样本t检验。P< 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、25 个关键靶点 PPI 构建与拓扑分析

将 106 个 SMI 靶点映射到 2064 个 KOA 靶基因中，得到 25 个 SMI 抗 KOA 关键靶点。根据 BC > 2.833、CC > 0.247、DC > 4、EC > 0.125、LAC > 1.333 和 NC > 2.083 对 25 个关键靶点拓扑分析，得到胱天蛋白酶 1(caspase 1，CASP1)、CASP3、CASP8、CASP9、核因子-κB 抑制因子 α(nuclear factor-κB inhibitor α，NFKBIA)、雌激素受体 1(estrogen receptor 1，ESR1)、过氧化氢酶(catalase，CAT) 核心关键靶点。

二、构建 25 个关键靶点复合目标网络

麦冬中麦冬酮 A(ophiopogonanone A)、鸟苷(guanosine)、豆甾醇(stigmasterol)、麦冬 A(ophiopogon A) 及尿苷(uridine)。红参中 β-谷固醇(beta-sitosterol)、人参皂苷 rh2(ginsenoside rh2) 是复合目标网络中主要有效化学成分。其中，β-谷固醇是调控关键靶点最多的有效化学成分(图 1)。

图1 SMI-关键靶点-KOA 复合目标网络图图2 GO 生物功能和 KEGG 通路富集分析柱形图 a：GO 生物功能分析柱形图；b：KEGG 通路富集分析柱形图Fig.1 SMI-key target-KOA composite target network diagramFig.2 Go biological function and KEGG pathway enrichment analysis histogram a: Go column chart of biological function analysis; b: KEGG pathway enrichment analysis histogram

三、GO 生物功能和 KEGG 通路富集分析

对 25 个关键靶点进行 GO 生物功能分析，包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF) 及细胞组成(cell composition，CC)(图 2a)。BP 主要涉及对脂多糖反应、对细菌来源分子反应、对抗生素反应等；MF 主要涉及半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程、半胱氨酸型内肽酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等；CC 主要涉及分子功能线粒体外膜、细胞器外膜、外膜等。KEGG 富集分析结果见图 2b，其中细胞凋亡(apoptosis) 富集程度最高。

四、核心关键靶点与对应有效化学成分的分子对接

选择 CASP1、CASP3、CASP8、CASP9、NFKBIA、ESR1、CAT 核心关键靶点，找到对应有效化学成分进行分子对接，以结合能判断其亲和力，结合能为负值说明受体与配体具有亲和力，< -5.0 kcal / mol 说明亲和力较好[14]。对接结果见图 3 及表 2，可见 CASP1、CASP3、CASP9、NFKBIA、ESR1、CAT 与 SMI 有效活性成分结合能均 < -5.0 kcal / mol，至少存在 1 个氢键，说明核心关键靶点与 SMI 有效化学成分具有较好亲和力，其中 stigmasterol 对接 CAT 存在 4 个氢键。

图3 核心关键靶点与对应有效化学成分的分子对接图 a～e：Beta-sitosterol 对接 CASP1 / CASP / CASP8 / CASP9；f～g：Stigmasterol 对接 ESR1 / CAT；人参皂苷 rh2 对接 NFKBIAFig.3 Molecular docking map of core key targets and corresponding effective chemical components a - e: Beta-sitosterol docked CASP1 / CASP / CASP8 / CASP9; f - g: Stigmasterol docked ESR1 / CAT; ginsenoside rh2 docked NFKBIA

表2 核心关键靶点与对应有效化学成分的分子对接结果Tab.2 Docking results of core key targets with corresponding effective chemical components

五、两组患者 WOMAC、SF-36 比较

观察组中 3例未按时完成 SMI 腔内注射， 1例随访丢失；对照组中 1例未按时完成透明质酸钠注射液腔内注射，1例随访丢失。治疗后 6 周、12 周、6 个月、12 个月，观察组 WOMAC 中疼痛、僵硬、功能评分低于对照组(P< 0.05)；观察组 SF-36 中躯体健康评分高于对照组(P< 0.05)(表3)。

表3 两组患者术后 WOMAC 和 SF-36 比较 (±s)Tab.3 Comparison of WOMAC and SF-36 between the two groups(±s)

表3 两组患者术后 WOMAC 和 SF-36 比较 (±s)Tab.3 Comparison of WOMAC and SF-36 between the two groups(±s)

变量 观察组(n = 61) 对照组(n = 63) t 值 P 值WOMAC 疼痛 6 周 10.45±2.38 12.91±2.41 5.717 0.000 12 周 6.28±2.05 10.26±2.12 10.621 0.000 6 个月 7.28±2.15 11.72±2.27 11.182 0.000 12 个月 6.14±2.11 10.12±2.24 10.187 0.000 僵硬 6 周 5.46±1.25 7.46±1.43 8.281 0.000 12 周 3.64±1.11 6.74±1.18 15.062 0.000 6 个月 3.12±1.03 4.85±1.16 8.771 0.000 12 个月 3.06±1.01 4.15±1.14 5.629 0.000 功能 6 周 33.85±5.65 51.23±5.74 16.992 0.000 12 周 20.23±4.57 42.64±5.52 24.585 0.000 6 个月 25.01±4.47 45.81±5.15 23.995 0.000 12 个月 22.34±4.98 28.57±5.07 20.195 0.000 SF-36 躯体健康 6 周 39.52±5.37 36.12±5.46 3.495 0.000 12 周 44.94±5.27 37.98±5.31 7.366 0.000 6 个月 43.02±5.33 37.14±5.23 6.221 0.000 12 个月 41.73±5.21 37.15±5.04 4.976 0.000 精神健康 6 周 52.85±4.27 52.72±4.32 0.169 0.867 12 周 53.77±4.11 53.93±4.28 0.212 0.832 6 个月 53.06±4.18 54.18±4.32 1.466 0.145 12 个月 52.52±4.34 54.04±4.42 1.932 0.056

六、观察组中治疗效果显著的典型病例

治疗后 12 个月骨髓病灶较治疗前明显缩小 ( 图 4a、b)。治疗前鞍点关节间隙 5.02 mm，内侧关节间隙 3.58 mm，治疗后 12个月，鞍点关节间隙增加至 6.48 mm，内侧关节间隙增加至 4.13 mm(图 4c、d)。治疗前软骨病变以及积液，治疗后 12 个月显示软骨再生，软骨形态更加完整，积液消失(图 4e、f)。

图4 观察组患者中治疗效果显著的典型病例膝关节 MRI a、b：治疗后骨髓病灶较治疗前明显缩小；c、d：治疗前及治疗后鞍点关节间隙由 5.02 mm 增加至 6.48 mm；内侧关节间隙由 3.58 mm 增加至 4.13 mm；e、f：治疗后显示软骨再生，软骨形态更加光滑，积液消失(注：蓝色线代表治疗前，红色线代表治疗后 12 个月)Fig.4 MRI of a typical case in the observation group a - b: Smaller bone marrow lesions after treatment; c - d: Sellar joint space increased from 5.02 mm to 6.48 mm after treatment, and medial joint space increased from 3.58 mm to 4.13 mm after treatment; e - f: Smooth cartilage regeneration without effusion after treatment(Notice: The blue line represented the image before treatment, while the red line represented the image 12 months after treatment)

讨论

临床上用于治疗 KOA 药物依其作用方式大体可分为改善症状与改善软骨代谢两大类。但是改善症状类药物不能从根本上逆转 KOA 病理发展。随着中药提取技术发展，应用中药制剂提取液治疗 KOA 报道也日渐增多，相关基础实验研究也均予以支持。SMI 能有效地保护软骨细胞及维持软骨的完整性，降低炎症细胞因子水平，对骨关节炎起到一定治疗作用[8]。本项研究通过网络药理学详细阐述 SMI 治疗 KOA 的物质基础及分子机制，并通过临床对照试验进行效果验证。证实 SMI 在 KOA 中具有多成分、多途径、多靶点协同干预作用特点，并可以有效逆转 KOA 病理发展，提高膝关节功能及生活质量。

本研究将 106 个 SMI 靶点映射到 2064 个 KOA 靶基因中，得到 25 个 SMI 抗 KOA 关键靶点，并构建出 SMI-关键靶点-KOA 复合目标网络图。麦冬中的麦冬酮 A、鸟苷、豆甾醇、麦冬 A 及尿苷；红参中的 β-谷固醇、人参皂苷 rh2 是复合目标网络中主要有效化学成分。该网络展现一种有效化学成分可以对应一个乃至多个靶点，多个靶点对应同一个有效化学成分，说明 SMI 在治疗 KOA 方面具有多成分、多靶点协同干预作用特点。麦冬酮 A 可以下调白介素-6(interleukin-6，IL-6) 和 IL-8 表达而抵抗因衰老导致的慢性炎症反应疾病[15]。鸟苷类似物可以降低大鼠关节炎特征，减少滑膜组织免疫细胞浸 润[16]。KOA 兔模型[17]及大鼠模型[18]结果显示豆甾醇可以降低软骨降解，并抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP) 表达。麦冬 A 通过抑制大鼠血浆或肺组织中 IL-6、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子 β1 等降低肺部炎症反应[19]。尿苷通过抑制 KOA 大鼠软骨细胞肥大和凋亡，具有抗炎反应伤害和软骨保护作用[20]。

β-谷固醇通过抑制脂多糖与 NF-κB 通路中 Toll 样受体 4 的结合，减轻小鼠炎症反应[21]，也可以促使 KOA 大鼠软骨完全再生[22]。人参皂苷 rh2 通过调节 NF-κB 通路减轻哮喘小鼠模型的过敏性气道炎症[23]，抑制血管内皮生长因子诱导的新生血管形 成[24]。因此，结合上述研究背景，SMI 治疗 KOA 中的有效化学成分具有抗炎反应、促进软骨再生及新生血管形成作用。

通过 GO 分析，结果显示 SMI 的关键靶点主要涉及脂多糖反应、细胞凋亡过程、线粒体外膜等生物学过程。KEGG 富集分析结果显示神经退行性变信号通路 - 多种疾病是 SMI 主要治疗 KOA 途径。但在 KOA 中，SMI 是如何抑制神经退行性变信号通路 - 多种疾病需要进一步研究。本研究通过拓扑分析得出 CASP1、CASP3、CASP9、NFKBIA、ESR1、CAT 是核心关键靶点，根据对应有效化学成分进行分子对接，结果表明 CASP1、CASP3、CASP9、NFKBIA、ESR1、CAT 与 SMI 有效活性成分的结合能均 < -5.0 kcal / mol。说明核心关键靶点与 SMI 有效化学成分具有较好亲和力。表明这些有效化学成分可能在治疗 KOA 中起着重要作用。但需要进一步的体内体外研究证实可能存在的治疗轴。CASP1 主要产生具有生物活性的 IL-1β 和 IL-18，触发炎性小体[25]，软骨退变及降解是 KOA 的显著特征，而细胞凋亡是软骨降解根本原因。而 CASP3、CASP9 参与细胞凋亡并促进 KOA 软骨降解过程[26]。NFKB1A 调节 NF-κB 信号通路，改变细胞因子表达谱，从而导致易感个体的炎症反应，参与髋部关节炎发 生[27]。ESR1 与 KOA 患者 IL-1β 和 IL-6 表达相关[28]并增加中国汉族女性 KOA 易感性[29]。CAT 参与氧化应激反应介导软骨细胞损伤[30-31]。

本研究详细阐述 SMI 治疗 KOA 的物质基础及分子机制。在此基础上本团队开展一项临床对照试验进行治疗效果验证。治疗后 6 周、12 周、6 个月、12 个月，观察组患者 WOMAC 中疼痛、僵硬、功能评分低于对照组患者；躯体健康评分高于对照组患者。表明 SMI 可以有效改善 KOA 的临床症状及提高生活质量。在随访末期，笔者还观察到一些患者骨髓病灶较治疗后明显缩小，关节间歇增加及软骨再生现象。SMI 治疗 KOA 的物质基础及分子机制研究结果正是上述研究结果背后机制。

综上所述，SMI 治疗 KOA 具有多成分、多途径、多靶点协同干预作用特点，能明显改善 KOA 的临床症状及提高生活质量并延缓 KOA 病程进展。