脂肪间充质干细胞治疗脑瘫的研究进展

胡 可，胡紫薇，古月明，唐小冬，温优良

（1. 赣南医学院2019级硕士研究生；2. 赣南医学院康复学院；3. 赣南医学院第三临床医学院，江西 赣州 341000）

现代医学的进步降低新生儿死亡率的同时增加了脑瘫患儿的发病率。脑瘫是导致儿童身体残疾的重要疾患，给家庭、社会带来沉重负担。目前临床上对脑瘫患儿主要采用药物、手术、康复治疗及高压氧等治疗手段，但这些治疗对脑瘫患儿疗效不稳定，更多是一种支持性治疗，尤其对一些重症患儿疗效不佳［1］。近年来，干细胞在治疗神经系统疾病方面的潜在作用受到广泛关注，特别是间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），如骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）、脐带间充质干细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）在治疗脑瘫的临床试验上表现出积极的结果［2-5］。近年，有研究证实脂肪来源的MSCs 即脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem ce11s，ADMSCs）在特定的诱导技术下，同样可以定向分化成多种类型的细胞和分泌多种生物活性因子［6］。目前，ADMSCs 除应用于皮肤组织缺损［7-8］、骨关节炎［9-10］、糖尿病［11-12］等疾病治疗外，有动物疾病模型实验也证实其在治疗神经系统疾病方面的可行性［13-14］，且在临床试验上也有案例报道证实其疗效［15］。本文主要对ADMSCs治疗脑瘫的应用及研究进展进行综述。

1 ADMSCs治疗脑瘫的取材优势

一直以来，骨髓和脐带是获取MSCs 的主要来源，并广泛地应用于临床与实验研究。但BMSCs 的获取不仅具有侵入性，增加感染风险，而且从骨髓中提取出的间充质干细胞的数量与质量也会受供体者年龄的影响［4］。同样获得足够数量的UCMSCs大约只能在40%的脐带样品中才能实现［2］。研究表明，人体脂肪中含有充足的ADMSCs，每毫升吸脂剂的干细胞数比骨髓中的干细胞数约高8 倍［16］，而且ADMSCs 具有稳定的增殖分化能力，可以避免因供体者年龄的增长而显著下降［17］。ADMSCs 另外一个优势是具有极低的免疫原性，即它可以逃避T 细胞的免疫识别而在异体内长期存活。产生此优势的原因可能是ADMSCs不表达共刺激表面抗原及其分泌的细胞因子形成了免疫抑制微环境对T细胞增殖具有直接抑制作用［18］。因此，ADMSCs 通常可以取自患儿的母亲脐周区域脂肪来实现异体移植治疗脑瘫，有效地避免伦理学上的争议。可见，ADMSCs凭借来源丰富、提取率高、伦理学争议性小、低免疫原性的取材优势，有望成为治疗脑瘫的良好种子细胞。

2 ADMSCs治疗脑瘫可能的机制

目前，ADMSCs 治疗脑瘫的机制虽然还不能完全明确，但有动物实验和临床试验研究证实它具有促进神经恢复和神经保护作用的特性，并可能通过以下直接或间接的作用机制来治疗脑瘫［19］。

2.1 直接作用直接作用是指脑瘫发生后，受损的脑组织会释放出多种生物活性因子，在“归巢”机制的作用下，引导移植入患儿体内的ADMSCs 容易穿过已受损的血脑屏障迁移至脑损伤区域而产生作用［20］。ADMSCs 到达受损组织处后，在受损组织的特定微环境诱导下，通过增殖分化发育为相应组织类型的功能细胞，使各个脑区的神经网络结构连接增加，从而改善脑瘫患儿的功能结局［21］。近年来，虽有体外实验已证实ADMSCs 可以向多种细胞类型分化，但其在体内可否直接分化替代受损细胞却存在争议［22］，有待进一步深入研究。

2.2 间接作用间接作用是指当ADMSCs 移植到患儿体内后可旁分泌各种生长因子来修复受损脑组织和营造良好的恢复微环境［23］，如血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）能促进损伤部位的血管再生，稳定损伤部位的血液循环；肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）可影响少突胶质细胞的发育和生长，加速髓鞘的形成；脑源性神经生长因子（Brain-derived neuro trophic factor，BDNF）可通过细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，Erk）磷酸化或TrkB 信号转导来改善低髓鞘化，还可以与神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）共同激活内源性神经干细胞再生［19］。另外，在这些生长因子的作用下能够对受损组织起到调节免疫反应、减轻炎症反应、抗氧化应激、抗纤维化、抗凋亡等多种共同作用［24-25］。这些间接治疗作用的潜力使得ADMSCs 移植成为治疗脑瘫的理想选择。目前，这种间接作用的机制也被大多数学者所接受。

3 ADMSCs治疗脑瘫的临床研究

3.1 临床试验的案例报道HIRANO A 等［26］首次报告1 例7 岁脑瘫患儿经过6 次静脉注射移植同种异体ADMSCs 后，评估了其治疗安全性和可行性。报告显示在随访12个月的时间里，患儿临床表现显著改善，生活质量及身心评分均显著提高，未见严重不良反应。此研究一定程度上反应同种异体ADMSCs 在脑瘫患儿中可安全有效地使用，但由于受试对象仅为1 例，其结果是否可推广到其他脑瘫患儿，需要进一步研究。

目前，ADMSCs 治疗脑瘫的临床试验侧重于对单个受试对象的疗效及安全性评价的研究。截止到2020 年1 月31 日从美国临床试验数据库（Clinicaltrials）查询到使用ADMSCs 治疗脑瘫的临床试验共2 项［27-28］，治疗缺血缺氧性脑病（Hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）的临床试验共1 项［29］（表1）。国内尚未见应用ADMSCs 治疗脑瘫的临床试验开展。

表1 ADMSCs治疗脑瘫的临床试验

3.2 临床试验的注意事项ADMSCs 治疗脑瘫要想在临床上得到广泛应用，仍需要开展更多标准化动物模型的临床前试验和多中心的临床随机对照试验来科学证实ADMSCs治疗脑瘫临床安全性和有效性。在已开展的MSCs 治疗脑瘫的临床试验中，受试者的年龄、给药途径、给药剂量及随访时间等方面均不一致，这就加大了临床试验的风险。参考其他来源的MSCs 治疗脑瘫的临床试验，为确保ADMSCs 治疗脑瘫临床试验的规范性必须考虑以下3个方面。

3.2.1 ADMSCs 的来源与制备ADMSCs 的低免疫原性优势决定治疗脑瘫的ADMSCs来源可以是自体的，也可以是异体的。有研究表示来自异体的ADMSCs 和自体的ADMSCs 在作用上没有差异，甚至接受同种异体MSCs 的患者较自体的不良反应更少［26］；但也有研究表明不同脂肪组织来源的ADMSCs 的分化能力具有差异性［18］，尤其是肥胖者脂 肪 中 的ADMSCs 分 化 潜 力 较 差［30］，因 此 对ADMSCs 来源的供体者要进行详细健康检查。目前，尚没有统一的ADMSCs制备方法，不同的方法制备质量也不同。实验室中较为安全、有效的方法是将采集到的脂肪组织经过缓冲液反复冲洗以获得纯度较高的脂肪颗粒，随后用适当浓度的Ⅰ型胶原酶或胰蛋白酶对这些脂肪颗粒进行连续消化离心，接着在无血清培养基内贴壁培养传代扩增，获取足够数量的ADMSCs悬浮液冷冻保存备用［26］。

3.2.2 ADMSCs 的鉴定与给药剂量临床试验中给脑瘫患儿注射的ADMSCs 试剂必须根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》的标准进行鉴定［31］。考虑到传代扩增带来的影响，临床试验中一般应采用3～5 代的ADMSCs。采用流式细胞技术对其表面的标志物进行鉴定，鉴定结果必须要符合国际细胞治疗协会规定的3 个标准［32］，才能保证治疗的安全性。采用台盼蓝染色和排除试验测定制备的ADMSCs 试剂存活率＞80%［26］，才能保证治疗的有效性。此外，还要对试剂进行细菌、支原体、内外源致病因子、内毒素水平、致瘤风险等检测［3，33］。只有给予足够数量的干细胞才能起到一定的疗效，但各临床试验的给药剂量不一致。在国内针对神经恢复的临床细胞治疗指南中建议通过静脉注射的方式UCMSCs 的给药剂量在5×105个·kg-1～8×105个·kg-1是安全可行的［34］，但实际临床试验中远远超过了这个剂量。

3.2.3 ADMSCs 的给药途径影响ADMSCs 治疗脑瘫疗效的主要因素在于ADMSCs能否准确到达受损部位。现有干细胞治疗给药途径包括腰椎穿刺蛛网膜下腔注射、脑立体定向手术和静脉注射等［4］。其中前两种给药方式能够更有效地将细胞输送到受损的脑组织区域，治疗效果更明显，但其给药过程具有较大的侵入性且不易控制治疗剂量，由此增加患儿的不良反应，甚至出现继发性损伤［4，35］。静脉注射相对比较安全，但注射后细胞大部分停留在肺毛细血管网中很难到达脑受损部位［36］，必须加大治疗剂量才能达到治疗作用，增加了治疗成本和肺栓塞形成的风险。目前，还没有对这三种给药途径的差异性进行研究对比的报道。在已开展的临床试验中大多采用静脉注射重复间隔给药方式，但对于年龄较大、症状较重的受试者可以考虑前两种给药方式。

3.3 临床试验的安全性和疗效评估在临床试验的过程中，要重视对受试对象安全性及疗效的客观反映才能使试验结果具有科研价值。在安全性评估方面，所有开展的临床试验都必须严格遵守《干细胞临床研究管理办法（试行）》的规定进行［37］。在试验前要对受试者进行全面的体格检查、实验室检查、心电图、胸片、脑部核磁共振等。有癫痫史、肝或肾功能不全、凝血功能障碍、严重过敏性或自身免疫性疾病等高危风险的患儿不应纳入试验对象［4］。在每次实施ADMSCs 移植时要监测受试者的生命体征［33］，移植后要密切关注其是否出现不良反应，且至少要随访半年以上。对于临床试验中出现的不良反应如发热、呼吸困难、白细胞减少等，应及时予以观察是否终止试验并做好记录。在疗效评估方面，临床检查和功能评定应贯穿整个治疗过程。在每次实施ADMSCs移植后应该采用各种评估工具详细地对受试者的运动功能、言语功能、心理状态、自我照顾、社会适应等方面进行评估，最好采用“双盲”进行疗效评估，以便更加客观地反映治疗效果。目前，常用的疗效评估量表有粗大运动功能测 试 量 表（GMFM-88）、改 良 的Ashworth 量 表（MAS）、改良Barthel 指数量表、脑性瘫痪综合功能评分量表和语言发育迟缓量表（S-S）等。这些量表在脑瘫疗效判断中具有较好的信度及效度，还可以避免因版权问题受到限制［38］。

4 小 结

尽管ADMSCs 治疗脑瘫的前景是乐观的，但临床推广仍存在一些争议。例如，通过静脉注射方式移植的ADMSCs 除在受损部位可检测到外，也会在肺和心脏等器官发现，且一段时间后很难在体内再检测到ADMSCs。这就增加了我们对ADMSCs 长期治疗作用的争议性和向肿瘤细胞分化的担忧，从而限制临床试验的开展。其实目前对ADMSCs治疗脑瘫最大的问题在于ADMSCs的体内增殖分化机制尚不完全明确以及缺少治疗后长期随访的疗效评价。其他方面的问题有：因脑瘫疾病诊断的滞后性，在治疗时机上错过最佳的治疗时间；缺少大样本的受试对象；联合治疗不规范以及最佳治疗剂量的未知等。总之，ADMSCs 凭借其良好的生物学特性在治疗脑瘫上展现出极大的潜力，现有的临床试验也表现出积极的结果。但由于基础研究欠缺和已开展的临床试验较少，我们还需要对ADMSCs 在体内的分化机制、最佳治疗时机、最佳治疗剂量等做进一步的研究。相信随着研究的深入开展，ADMSCs 移植治疗脑瘫有望彻底实现临床转化。