重复经颅磁刺激对小鼠缺血性脑卒中急性期小胶质细胞极化的调控作用

方莹莹，张靖慧

（1. 南方医科大学基础医学院；2. 广东省康复医学会；3. 中山大学附属第三医院康复医学科，广东 广州 510630）

缺血性脑卒中（Ischemic stroke，IS）是由多种因素导致脑血流量降低所引起的脑血管疾病。根据其病程可分为急性期（＜2 周）、恢复期（2 周～6 个月）、后遗症期（＞6 个月）。如对处于急性期的缺血性脑卒中患者进行及时的干预治疗，其预后良好［1-2］。重复经颅磁刺激（Repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）属于一种无痛、无创的康复治疗技术，其通过磁脉冲信号作用于单侧特定皮质部位，磁刺激信号连续不断的穿透颅骨对脑功能进行调节，改善脑功能［3-5］。小胶质细胞（Microglia，MG）是中枢神经系统固有的免疫效应细胞，分布于灰质和白质中，约占脑细胞总数的10%［6］。MG 未激活时保持静息状态，不具有吞噬能力，但具有一定程度的迁移和吞饮能力，可监察脑实质内微环境的状态，及时清除坏死的神经元，维持中枢神经系统的平衡。当大脑出现炎症、感染和创伤时，MG 被激活呈现其吞噬功能，在一些脑部疾病中，MG 不仅能发挥其吞噬功能，也可促进相关组织恢复、神经再生［7］。目前相关研究显示rTMS 不仅用于IS 的功能评估和预测预后，还可促进IS脑功能恢复［8］，但其作用机理有待继续深究。本研究将rTMS 作用于急性期缺血性脑卒中模型小鼠，探究rTMS对小胶质细胞极化作用的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及试剂线栓（豫顺生物，型号：0622），TTC（Sigma，No：T8877），Trizol 试剂（Takara，#9109），cDNA 合成试剂盒（Takara，#6130），rTMS 治疗仪（武汉依瑞德公司CCY-Ⅰ型）。

1.2 实验动物与分组SPF 级健康雄性C57BL/6小鼠80 只，体重20～22 g［动物合格证号：SCXK（粤）2016-0041］。本研究方案经南方医科大学动物研究委员会批准。动物可随意获取食物和水，自动控制昼夜循环（12/12 h），室温（22±1）℃，将小鼠饲养在12 h 光—暗循环下，并允许在手术后自由获取食物和水。采用随机分组的方法将小鼠分为4 组：假手术组、MCAO 对照组、rTMS 干预组及假刺激组，每组20只。

1.3 小鼠大脑中动脉缺血（MCAO）模型制作［9-10］C57BL/6 小鼠，异氟烷诱导麻醉，待完全失去知觉后，仰卧固定于手术台上。颈部正中剪开皮肤，分离出颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，颈外动脉上的2 个小动脉分支用电烙铁烫断凝固。颈外动脉远心端用5-0 手术线打死结，拉紧结扎，近心端用4-0 手术线打死结，中间用5-0 手术线打活结，颈总动脉用4-0 手术线打活结。然后插入线栓，勒紧5-0 手术线以固定线栓，然后剪开近心端处的4-0 手术线，继续插入线栓至颈外颈内动脉分叉处。剪断颈外动脉远心端，拉住断端使线栓掉头，然后顺势插入线栓，感到有阻力后停。小鼠缺血1.5 h，缺血期间放入恒温恒湿箱，待缺血完毕后，拔出线栓，缝合皮肤。

1.4 rTMS 刺激假手术组和MCAO 对照组小鼠不做任何处理，自然饲养。rTMS 干预组小鼠头部固定于MagLite 磁刺激仪上的动物线圈，线圈直径12 mm，头皮紧贴线圈，中心位于小鼠右耳前3 mm。设置磁刺激频率为10 Hz，强度为70%最大输出强度，拔栓1 h 后开始刺激，连续刺激20 次为1 组，每天2 组，连续刺激5 d。假刺激组同干预组实验条件一致，但磁刺激仪不通电。

1.5 转棒实验术前1 d 及术后3 d、5 d 进行转棒实验。将小鼠放在加速旋转的转棒上（5 min 内从4 r·min-1加速到40 r·min-1），直到小鼠掉落，记录停留时间，5 min 内仍未掉下按5 min 计算。每只小鼠每日进行3 次实验，实验间隔20 min。

1.6 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色麻醉小鼠取脑，放入0.1 M PBS的冰水混合物中，2 min后大脑变硬，取出放入脑槽，以1 mm间距切片，然后放入2%TTC染液中（0.1 M PBS配制），室温，正反面各染5 min，然后放入4%甲醛溶液中固定，6 h后拍照。

1.7 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测使用Trizol 试剂从半暗带脑组织中提取总RNA。RNA 定量后，使用cDNA 合成试剂盒将RNA 转录为cDNA。使用7500 Real-Time PCR 系统，根据试剂盒说明书，使用Bestar SybrGreen qPCR-masterMix（DBI，USA）检测目的基因的表达水平。根据2-ΔΔCt计算方法来计算结果。引物序列如表1所示。

表1 qPCR引物序列

1.8 统计学方法使用SPSS 19.0 软件进行统计学计算，计量资料以±s 表示，小鼠转棒实验采用重复测量方差检验，qPCR 实验采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 rTMS 刺激减少脑梗死灶及促进神经功能恢复脑组织TTC 染色结果（图1A）显示，假手术组未见脑梗灶，而MCAO 对照组与假刺激组梗死灶明显，rTMS刺激明显减小梗死灶。同时转棒实验结果（图1B）显示，rTMS 刺激组小鼠在转棒仪上待的时间长于MCAO 对照组及假刺激组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 rTMS刺激减少脑梗死灶及促进神经功能恢复

2.2 rTMS 刺激抑制小胶质细胞M1极化，促进M2极化RT-qPCR 检测结果显示，MCAO 对照组iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6 表达水平高于假手术组，Arg1、Ym1 表达水平低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），IL-10 表达水平与假手术组无明显差异；MCAO 对照组和假刺激组在各项指标上无明显差异；rTMS 干预组的iNOS、TNF-α、IL-1β 表达水平低于MACO 对照组，而IL-10、Arg1、Ym1表达水平高于MCAO 对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），IL-6 表达水平与MCAO 对照组无明显差异。见图2。

图2 rTMS刺激促进小胶质细胞M2极化

3 讨 论

脑卒中因其高致死、高致残、易复发的特点成为当今严重威胁公众健康的重大疾病，其中缺血性脑卒中占87%［11-12］。此前对缺血性脑卒中的研究主要集中在血管阻塞、氧化应激对于血管的损伤及脑组织缺氧缺血导致神经元坏死和凋亡，对于机体自身的相关免疫反应研究尚不充分。正常机体中枢神经系统中MG 处于静息态，当机体脑部组织受到炎症、缺血等外界因素刺激时，静息态MG 迅速被激活，细胞形态发生变化，由分枝状转变为阿米巴样，且吞噬功能和迁移作用增强。根据MG 发挥的作用不同，可分为M1 型和M2 型。M1 型是促进炎症反应发生的细胞，具有明显的神经毒性作用，M2 型又分为M2a、M2b、M2c 3 种亚型，是促进血管生成及炎症修复的细胞。正常状态下，M1 和M2 处于动态平衡，一旦机体受到外界因素刺激或病理状态下，平衡将会被打破，同时M1型MG 将会在相关因子的作用下向M2 型极化，在炎症后期发挥抗炎作用，促进损伤修复［13-14］。

rTMS因其无痛、无创、无损的特点，在脑部疾病的治疗上具有极大的优势［15］。有研究证明rTMS 干预能够促进IS 的恢复，不仅可以兴奋运动皮层，还可刺激神经再生［16］。目前认为rTMS 的作用机制与突触可塑性相关，且rTMS与神经的调控和频率具有极大的相关性。高频rTMS（＞1 Hz）对神经兴奋性的调控表现类似长时程增强（Long-temm potentiation，LTP）作用，因而本次研究我们使用高频rTMS进行研究。

本研究光镜的观察结果显示rTMS 干预组海马组织病理情况优于MCAO 对照组和假刺激组。iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6 等因子是M1 型MG 的功能性标记物，其中iNOS是促进谷氨酸和NO分泌的酶，谷氨酸和NO 分泌过多会加重炎症反应，导致神经系统的微环境失衡，最终致使神经元变性、坏死。而IL-10、Arg1、Ym1是M2型MG的功能标记物，是M2型MG 分泌的神经保护因子。我们对iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg1 及Ym1 等炎症相关因子进行检测，检测结果显示MCAO对照组iNOS2、TNF-α、IL-1β、IL-6 表达水平显著高于假手术组；MACO 对照组和假刺激组的iNOS2、TNF-α、IL-1β、IL-6 表达水平显著高于rTMS 干预组，而IL-10、Arg1、Ym1 表达水平显著低于rTMS干预组。提示rTMS干预对于M1 型向M2 型MG 的极化有促进作用，可降低炎症反应，促进IS带来的炎症恢复。

综上所述，rTMS作用于急性期缺血性脑卒中可恢复相关梗死区域的功能，其作用机制可能是通过抑制小胶质细胞M1 的极化，促进小胶质细胞M2 的极化，降低炎症反应。