除虫脲在人工胃/肠液和肠道菌群及生物样品中的稳定性研究

陶 琦，徐玉珍，秦 哲，白莉霞，刘希望，李世宏，杨亚军，李剑勇

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，农业农村部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 730050)

随着生活水平的提高，人们对动物性食品的需求量不断增加。在畜牧养殖业的发展过程中，人们对养殖环境的卫生状况也越来越重视。蝇类的繁殖能力强，分布广泛，可在养殖场环境中大量孳生，不但袭扰动物和养殖人员，还可传播多种疾病，给养殖场的正常生产及生活造成干扰，同时也是养殖场生物安全的威胁之一。目前，不同规模的养殖场均存在蝇类孳生的问题，通常采用环境、生物、物理、化学等措施进行蝇虫数量的防控[1-3]。其中，在化学防控措施中，环丙氨嗪(cyromazine)已在国内被批准使用于鸡[4-7]；除此之外，在国外畜牧养殖过程中除虫脲的使用亦较为广泛[8]。

口服是最为便捷的给药途径之一。但大多数药物经口服给药后，会受到胃肠道中多种因素的影响，如胃液的酸性和肠液的碱性环境、胃肠道消化酶、肠道上皮细胞中的酶，以及肠道菌群的影响等，使其在到达作用部位前发生降解和代谢。前期研究发现，除虫脲在动物体内代谢较少，绝大部分以原型药随粪便排出[16-20]。本研究拟采用高效液相色谱(HPLC)，考察DFB在人工胃/肠液和生物样品中的稳定性，同时还考察了大鼠肠道菌群对DFB的降解作用，为后续的制剂设计和开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

除虫脲标准物质(中国计量科学研究院，批号：19001，纯度>99.8%)；乌拉坦(NJKOCED)；胰蛋白酶(酶活 250NFU/mg，索莱宝，批号：T8150)；胃蛋白酶(酶活3 000～3 500 NFU/g 索莱宝，批号：P8390)；磷酸盐缓冲液(索莱宝，批号：D1040-500)；厌氧培养基(CM1513 北京陆桥)；泊洛沙姆188(索莱宝，批号：S7070)；乙腈(色谱纯，Fisher)；盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠等均为国产分析纯试剂。

1.2 主要仪器

超高效液相色谱仪-紫外检测器(DAD)，安捷伦1290；匀浆机(IKA-T25)；离心机(Multifuge X3R)；厌氧培养箱(Thermo)。

1.3 试验动物

6只清洁级SD大鼠，雄性，8～10周，体质量210～230 g，购于中国农业科学院兰州兽医研究所，动物生产许可证号：NKMYD201907018。

1.4 溶液配制

1.4.1 储备液与溶液 称取除虫脲标准物质适量，以乙腈溶解制成质量浓度为1 mg/mL的储备液，于4 ℃储备。使用前用乙腈稀释得到相应质量浓度的对照品溶液。

1.4.2 人工胃液的制备 按文献[21]的方法，取稀盐酸(取盐酸234 mL，加水稀释至1 000 mL)16.4 mL，加水约800 mL与胃蛋白酶10 g，摇匀后，用3.65 g/L盐酸溶液调pH至1.3，然后加水稀释并定容至1 000 mL，即得人工胃液。空白人工胃液的配制：除不含胃蛋白酶，其余与人工胃液配制相同。

1.4.3 人工肠液的制备 按文献[21]的方法，取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 mL使其溶解，用4 g/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8；称取胰蛋白酶10 g，加适量水溶解；将上述两种溶液混合后，再加水稀释并定容到1 000 mL，即得人工肠液。空白人工肠液的配制：除不含胰蛋白酶，其余与人工肠液配制相同。

1.4.4 SD大鼠肠道菌群的制备[22-23]SD大鼠禁食12 h刺激腹部采集新鲜粪便。将粪便与生理盐水按比例(1 g︰5 mL)涡旋混合制成悬浊液，2 000 g离心10 min(4 ℃)，再将上清液与厌氧培养液按比例(1︰9)混合，置厌氧培养箱中过夜，制得肠道菌群培养液，待用。

1.4.5 空白组织样品的制备[24-26]取SD大鼠(230～250 g)6只，禁食不禁水过夜，腹腔注射乌拉坦麻醉，迅速处死，取出肝脏、胃、小肠和大肠，用预冷的磷酸盐缓冲液(4 ℃预冷2 h)冲洗表面后剪碎，再将各组织与磷酸盐缓冲液按比例(1 g︰5 mL)混合，置于匀浆机中均质后，2 000 g离心10 min(4 ℃)，取上清液，备用。上述操作均在冰浴条件下进行。

1.4.6 厌氧培养基的制备 称取厌氧培养基 9.5 g，加水800 mL摇匀，然后加水稀释并定容到1 000 mL，高压灭菌后分装到试管中，制成厌氧培养基(GAM)，4 ℃保存，备用。

1.5 色谱条件与方法学考察

1.5.1 色谱条件 参照文献[27]，略有调整。Phenomenex luna C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相(A)为6.3 g/L甲酸铵，(B)为乙腈，等度洗脱(A与B的体积比为40︰60)；进样时间15 min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。

1.5.2 方法学考察 方法专属性：分别取空白人工胃液、空白人工肠液、人工胃液、人工肠液、人工胃液+DFB储备液、人工肠液+ DFB储备液、空白人工胃液+ DFB储备液、空白肠道菌液、空白肝液、空白胃液、空白大肠及其内容物、空白小肠及其内容物。按照“1.5”项下的样品处理方法操作后，按“1.5.1”项下的色谱条件进样分析，对比色谱图。观察BFD标准品的出峰位置是否有其他物质干扰。

精密度试验：精密吸取DFB储备液10、40、100 μg/mL各1份，在不同时间点(0 h、4 h、8 h、12 h、24 h)按照 “1.5.1”项下条件进样分析，记录峰面积。

重现性试验：精密吸取DFB储备液10、40、100 μg/mL各6份，再按“1.5.1”项下进样1次，记录峰面积。

1.6 样品处理

1.6.1 人工胃/肠液样品处理 移取DFB储备液4份(1 mg/mL)，每份500 μL，分别置于 50 mL容量瓶中，由于DFB的水溶性差，在人工胃、肠液加入一定量的增溶剂泊洛沙姆188，以增加DFB在样品中的溶解性，然后分别用处理过的空白人工胃液、空白人工肠液、人工胃液、人工肠液稀释并定容，充分混匀后，再分装EP管中(每管 1 mL，每个时间点平行3份)，于37 ℃水浴中孵育不同时间后分别取样300 μL，加入冰乙腈700 μL以终止反应，涡旋混匀，于4 ℃下14 000 g离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜后，按 “1.5”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。

1.6.2 SD大鼠肠道菌群处理 在前述过夜培养液加入一定量的增溶剂泊洛沙姆188，以增加DFB的溶解性，移取1 mL培养液于EP管中，分别加入DFB储备液10 μL，涡旋混匀后置入厌氧培养箱，培养不同时间后分别取样0.5 mL于EP管中(每个时间点平行3份)，加入冰乙腈(-20 ℃预冷2 h)1 mL以终止反应，12 000 g离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜后，按“1.5”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。以培养相同时长不含DFB的培养液为空白对照，同法 操作。

1.6.3 空白组织样品处理 在上清液中加入一定量的增溶剂泊洛沙姆188来增加DFB在样品中的溶解性。将上述制备好的上清液迅速分装到EP管中(每管1 mL，每个时间点平行3份)，加入DFB储备液10 μL，混匀后置37 ℃水浴中孵育不同时间后，移取300 μL，加入700 μL冰乙腈以终止反应，涡旋2 min，14 000 g离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜后，按“1.5”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。

2 结果与分析

2.1 方法专属性

如图1所示，在该色谱条件下，DFB能被检出，保留时间为5.30 min，分离度良好，不受其他物质干扰。表明样品测定条件以及处理方法具有专属性，不受基质干扰。

2.2 精密度试验

DFB低、中、高3种质量浓度在不同时间点测得峰面积如表1所示。RSD 值为分别为 0.1%、0.12%、0.18%，表明仪器精密度良好。

表1 精密度试验结果

2.3 重现性试验

不同样品测得峰面积见表2。RSD值分别为0.1%、0.12%、0.18%，表明方法的重现性良好。

表2 方法重现性结果

2.4 DFB在人工胃/肠液中的稳定性

以0 h时DFB的峰面积为100%，计算各时间点的剩余百分比，结果见图2。如图所示，经过6 h、37 ℃孵育后，在空白胃液、人工胃液及空白肠液、人工肠液中的相对剩余百分率分别为(93.23±1.55)%、(92.46±2.33)%、(82.97± 1.13)%、(77.41±0.74)%。结果说明，在碱性或胰蛋白酶存在的条件下，DFB相对于在酸性或胃蛋白酶存在的环境中更易被降解；DFB在碱性或胰蛋白酶的条件下稳定性较差(约下降20%)，而不易受酸性及胃蛋白酶的影响。

2.5 DFB在SD大鼠肠道菌群中的稳定性

以0 h时DFB的峰面积为100%，计算各时间点的剩余百分比，结果见图3。如图所示，经过12 h、37 ℃ 孵育后，DFB在SD大鼠肠道菌群中孵育时发生了相对降解，但相对剩余百分率在90%上，总体表现出稳定的趋势。结果表明，DFB不易受SD大鼠肠道菌群的影响。

2.6 DFB在生物样品中的稳定性

以0 h时DFB的峰面积为100%，计算各时间点的剩余百分比，结果见图4。如图所示，经过6 h、37 ℃孵育后，在胃液、肝液、大肠及其内容物、小肠及其内容物的相对剩余百分率分别为(93.05±0.84)%、(95.38±0.7)%、(94.58± 0.424)%、(84.06±0.212)%。结果表明，DFB在胃液、肝液、大肠及其内容物中基本稳定，但在小肠及其内容物中有一定的降解(约16%)。

3 讨 论

口服药物在胃肠道环境下的稳定性考察，是新药开发的重要研究内容，而药物在胃肠道中的含量变化是关键环节。本试验采用液相色谱法，考察了DFB在人工胃/肠液、肠道菌群及生物样品中的稳定性。结果发现，DFB在空白胃液和人工胃液中有一定降解，但DFB的剩余百分比均在90%以上，总体表现出稳定趋势。DFB在空白肠液和人工肠液中发生降解(约20%)，表明在碱性或胰蛋白酶存在的条件下，DFB相对于在酸性或胃蛋白酶存在的环境中更易降解。此结果与前期的研究结果相似，左三龄等[27]研究发现，DFB在酸性介质中稳定性较碱性条件下更为稳定。

鉴于进入肠道的药物会受到肠道菌群的影响，本研究另外测定DFB在SD大鼠肠道菌群中的稳定性。结果显示，DFB在SD大鼠肠道菌群中表现出稳定的趋势，说明肠道菌群对DFB几乎没有代谢作用。为了使试验条件更加接近生物体内代谢环境，本研究检测了DFB在生物样品中的稳定性，发现DFB在大鼠肝脏、大鼠胃液、大鼠大肠及内容物中都表现出稳定的趋势，而在大鼠小肠及内容物中有降解(约16%)，这与上述DFB在空白肠液和人工肠液中的结果较为一致。

综上所述，DFB在碱性及胰蛋白酶存在的条件下有一定的降解，表明DFB在动物体内的代谢主要发生在小肠。

该研究结果表明，DFB在开发口服制剂时需要进行特殊的处理来防止DFB在体内的降解，同时也为DFB的后续研究提供数据基础。