冀东稻区基于低温复合菌系HT20的秸秆腐解因素研究

孙建平，刘雅辉，马 佳，赵子婧，陆 垚，何宗均，吕晶晶

(1.河北省农林科学院 滨海农业研究所，河北唐山 063299；2.河北省农林科学院遗传生理研究所，石家庄 050051；3.天津市农业科学院，天津 300000)

水稻秸秆含有大量有机质及植物生长所必须的氮、磷、钾及其他微量元素，是农田养分循环利用的基础[1-2]。冀东滨海地区水稻种植面积约为6.67万hm2，秸秆产生量约为65万～70万t，由于缺乏秸秆高效利用技术，大多数被直接焚烧，不仅造成大量生物质资源的浪费和大气污染，而且对土壤生态系统造成严重的破坏[3]。近年来，当地政府大力提倡秸秆直接还田，但由于北方秋冬季节气温偏低且持续时间长，秸秆粉碎后在田间自然状态下腐熟慢，不利于田间耕作和农艺操作[4-6]，特别是自然状态下腐熟时恰逢水稻缓秧分蘖期，土壤中大量CH4、N2O、CO2和有机酸产生，严重影响水稻秧苗根系的生长[7]，秸秆降解慢、不充分是制约该区域秸秆还田的关键因素，限制了北方水稻秸秆还田的大面积推广应用。

目前，添加腐熟剂是解决秸秆快速腐解的主要措施[8-9]。研究表明腐熟剂促进秸秆分解[10]，减少温室气体排放[11]，有利于改良土壤理化性状[12]和微生物群落活性与多样性的提高[13-14]，增加产量[12]，并且还可以固定铬[15]。但秸秆还田条件下腐熟剂与土壤质地间响应不同[16]，水稻田干湿交替，需要厌氧和好氧微生物群落的交替作用,市面上的大多数产品以好氧微生物居多，加上低温环境下微生物难以生长，活性降低，田间效果不理想，因此，亟需寻求在低温条件下可以启动的微生物产品，用于北方水稻秸秆直接还田。

低温复合菌系因其可以实现腐解的快速启动，并产生大量有益微生物，引起了各类学者的广泛关注，目前较多应用于玉米秸秆及牛羊鸡猪粪等多种废弃资源的堆肥中[17-19]，而在北方水稻秸秆直接还田应用中研究很少。农田秸秆综合利用课题组前期从冀东滨海稻区水稻秸秆还田土壤中通过低温胁迫、富集筛选、拮抗试验、组合构建了由白蚁菌、长柄木霉、芬莱氏链霉菌、葡萄球菌等组成的低温复合菌系HT20，并初步应用于冀东稻区水稻秸秆还田，实现了低温环境下秸秆的快速腐解。为了更好地发挥其作用，本研究以低温复合菌系HT20为研究对象，采用响应曲面法(response surface method，RSM)，通过室内培养和大田微区试验，研究HT20添加量、尿素添加量、温度和含水率及其互作对秸秆腐解率的影响，预测HT20作用下秸秆的最佳腐解条件，并与市面常用的4种秸秆腐熟剂进行比较，分析其对秸杆的腐解程度和土壤的肥力影响，阐释其对水稻秸秆的腐解效果和适应性，为低温复合菌系HT20应用水稻秸秆还田提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点与概况

研究区域位于河北省唐山市曹妃甸区滨海现代农业综合试验站(39°16′31″N，118°27′5.14″E)，距渤海约4.5 km，海拔2.5～4.3 m，该地区属于东部季风区暖温带半湿润季节型近海大陆性气候，具有光照充足，降水集中，雨热同期，四季寒暖干湿分明等气候特征[20]。2010—2019年月平均气温12.3 ℃，蒸发量平均为1 969 mm，冬季盛行偏西北风，春、夏季盛行偏南和东南风，秋季多偏西南风。年降水量为635.9 mm，主要集中在7—8月份。

1.2 试验材料

盆栽试验的土壤来源于长期种植水稻的土壤，土壤类型为盐渍型滨海粘壤土，0～20 cm耕层土壤理化性质：电导率为602 μS·cm-3，pH为8.16，有机质5.45 g·kg-1，速效磷24.35 mg·kg-1，速效钾102.71 mg·kg-1，速效氮为30.56 mg·kg-1，体积质量为1.45 g·cm-3。还田秸秆选用前茬水稻所产生的秸秆，水稻秸秆的养分含量：C/N 67，全氮为0.68%，全磷为 0.13%，全钾为1.34%，选用河北省农林科学院滨海农业研究所自研水稻品种‘垦育979’。供试腐熟剂分别为低温复合菌系HT20(自研)；农富康(农富康生物科技有限公司)；还田宝(北京百丰天下生物科技有限公司)；春雨(苏州农旺生物科技有限公司)；启明(湖北启明生物工程有限 公司)。

1.3 试验设计与样品采集

1.3.1 低温复合菌系HT20高效腐解条件优化 以温度、含水量、HT20添加量、尿素添加量为试验因素，各因素设置3个试验水平，采用Design-expert 8.0.6软件中的Box-Behnken方法进行设计(表1)，其中有5个重复中心点，共29个处理，各处理均设置5个重复。在已灭菌的250 mL锥形瓶中加入秸秆5.000 g，然后按照设计加入相应量的HT20和尿素，采用无菌水调节含水率，封口膜封口，置于相应温度的恒温培养箱中避光培养。30 d后，取出锥形瓶测定秸秆腐解率。

表1 试验因素与试验水平

1.3.2 不同腐熟剂对水稻秸秆还田土壤和秸秆腐解效果 设置未施用腐熟剂秸秆直接还田为对照(CK)，施用低温复合菌系HT20秸秆还田(低温复合菌系)、施用农富康秸秆直接还田(农富康)、施用还田宝秸秆直接还田(还田宝)、施用春雨秸秆直接还田(春雨)、施用启明秸秆直接还田(启明)，共6个试验处理。建立大田微区，每个微区规格为600 cm×200 cm×60 cm，其中摆满塑料桶(规格56 cm×58 cm)，桶四周及底部扎孔增加土壤的透气与水分的流出，桶与桶之间的缝隙用土填满，每个处理安排在一个微区中，3个微区为3次重复，防止微区之间相互污染，降低试验误差。试验采用尼龙网袋填埋法，尼龙网袋规格为长×宽=50 cm×45 cm，孔径为0.178 mm，以隔离土壤。供试稻草剪切至约5 cm放入尼龙网袋中，用尼龙线绑好袋口，水稻秸秆还田量按10 500 kg·hm-2算，每袋装稻草262 g，于2019年11月23日施用腐熟剂处理每袋加入1 g与秸秆进行混匀后埋入塑料桶中土下15～20 cm处，未施用腐熟剂直接埋入。于2020年5月中旬移栽水稻秧苗，插秧密度按照30 cm×16 cm，每穴5株。各处理全生育期田间管理与常规田间管理措施。

各处理于秧苗移栽后30 d、90 d和150 d时取5袋样品，清理干净尼龙网袋上的土粒，烘干，测定秸秆的残留量，计算秸秆腐解率。土壤样品在拔去水稻根后，自主根系位置自上而下(从表面至塑料桶底，约20～25 cm深)，用土钻(钻头直径为3.8 cm)，取下约500 g土壤样品，带回实验室，200 g新鲜的土样用于测定微生物，300 g土样在通风处自然风干，去根系杂质，过筛，用于测定土壤的化学性质。

1.4 测定方法

土壤微生物采用经典的稀释平板法[21]，其中细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基；真菌采用PDA培养基；放线菌采用改良高氏1号培养基、有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定；速效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定；速效钾采用原子吸收分光光度计法测定[22]。

秸秆腐解速率=(原始秸秆质量-剩余秸秆质量)/t

秸秆残余率=剩余秸秆干质量/原始秸秆干质量×100%

为进一步比较不同处理秸秆腐解动态，本研究用修正后的Olson指数衰减模型来拟合[23]，其形式为：y=x/x0=e-kt

公式中，y为秸秆腐解残余率(%)；x0、x分别为腐解开始时和腐解后t时的秸秆量(kg)；k为腐解速率常数，k越大，分解速度越快。

根据公式y=x/x0=e-kt中的k来计算秸秆分解50%(T50)和95%(T95)所需的时间(d)，计算公式为：T50=ln0.5/(-k)，T95=ln0.05/(-k)。

1.5 数据分析

采用Design-Expert 8.0.6进行Box-Behnken中心组合试验设计及回归方程方差分析，采用 Excel 2017进行原始数据的整理与作图；采用SPSS 22.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)比较不同处理间差异。

2 结果与分析

2.1 回归模型的建立

对影响秸秆腐解率的4个关键因素进行试验，利用Design-Expert软件中Box-Behnken 设计了29组试验(表2)，其中有5个重复中心点，结果显示腐解率为7.69%～62.27%。对数据进行多元回归拟合获得腐解率的二次多项式回归模拟方程为：R=-25.872 35+0.479 81A+ 0.863 86B+16.344C-63.606 67D+ 0.015 573AB-0.085 333AC+17.766 67AD+0.06BC+1.422BD+5.5CD+0.000 752 593A2-0.006 432 27B2-17.000 67C2-1 696.066 67D2。式中，R为秸秆腐解率(%)，A为温度(℃)，B为含水率(%)，C为尿素添加量(mg)，D为HT20添加量(g)。

表2 Box-Behnken 设计的不同试验处理及其响应值

对秸秆腐解率的模拟方程求极值得知，当温度为5 ℃，含水率为80.76%，HT20添加量为 0.04 g，尿素添加量为0.6 mg时，秸秆的腐解率可达到22.6%；当温度为10.86 ℃，含水率为90%，HT20添加量为0.080 g，尿素添加量为 0.600 mg时，秸秆的腐解率可达到36.7%；当温度 20 ℃，含水率为88.59%，HT20添加量为 0.080 g，尿素添加量为0.300 mg时，秸秆的腐解率可达到64.09%。表明低温复合菌系HT20在 5～20 ℃可以腐解秸秆。

2.2 回归模型的方差分析和方程回归系数的显著性检验

为了检验方程的有效性，对腐解率的数学模型进行方差分析(表3)，模型的P值小于 0.000 1，模型极显著。模型方程失拟项P值为 0.286 3，差异不显著。说明秸秆腐解率与温度、含水率、尿素添加量、HT20添加量之间具有高度的相关性(R2=0.955 1)，校正相关系数AdjR2为 0.910 1，说明腐解率的模拟模型与实际情况高度吻合。

从回归系数的显著性检验(表3)可以看出，4因素的显著性概率为温度≈含水率

表3 回归模型的方差分析和回归系数显著性检验

2.3 响应曲面结果分析

由温度、含水率、HT20添加量和尿素添加量4因素交互作用对秸秆腐解率影响的三维空间响应曲面图(图1)可以形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。从温度和含水率交互作用影响秸秆腐解率的曲面图可知(图1-A)，当HT20添加量为0.050 g，尿素添加量为0.500 mg，若含水率固定时，腐解率随温度升高而增加，若温度固定时，腐解率随含水率增加而增加，变化幅度大。通过颜色可以看出温度与含水率交互作用对秸秆腐解率影响显著。

温度和HT20添加量交互作用影响秸秆腐解率的曲面图可知(图1-B)，当含水率65%，尿素添加量0.500 mg时，若HT20添加量固定时，腐解率随温度升高呈增大的趋势，且变化幅度明显；若温度固定时，腐解率随HT20添加量的增加呈先增加后降低的趋势，并出现了拐点。通过颜色可以看出温度与HT20添加量交互作用对秸秆腐解率影响显著。

HT20添加量和尿素添加量交互作用影响秸秆腐解率的曲面图可知(图1-C)，当温度 12.5 ℃，含水率65%，若HT20添加量固定时，腐解率随尿素添加量呈先增加后降低的趋势，变化比较缓慢，若尿素添加量固定时，腐解率随HT20添加量呈先增加后降低的趋势，变化比较缓慢，并出现了拐点。HT20添加量和尿素添加量交互作用对秸秆腐解率影响不显著。

HT20添加量和含水率交互作用影响秸秆腐解率的曲面图可知(图1-D)，当温度12.5 ℃，尿素添加量为0.500 mg，若含水率固定时，腐解率随HT20添加量呈先增加后降低的趋势，并出现了拐点；若HT20添加量固定时，腐解率随含水率的增加而增加，变化幅度较明显。HT20添加量与含水率交互作用对秸秆腐解率影响不显著。

2.4 HT20对冀东稻区还田秸秆腐解效果的影响

由图2-A可知，秸秆腐解速率随时间的变化呈现先增加后降低的趋势。与不添加腐熟剂(CK)和常用腐熟剂相比，在秧苗移栽30 d，低温复合菌系HT20增加秸秆的腐解速率28.31%～81.46%；在秧苗移栽90 d，低温复合菌系HT20增加秸秆的腐解速率20.10%～35.11%；在秧苗移栽150 d，低温复合菌系HT20增加秸秆的腐解速率31.68%～53.61%。由图2-B可知，与不添加腐熟剂(CK)和常用腐熟剂相比，秸秆分解50%所需时间提前17.62～42.44 d，秸秆分解95%所需时间提前50.12～183.41 d，表明HT 20可以加快冀东稻区还田秸秆的腐解速度。

2.5 HT20对水稻秸秆还田土壤的影响

通过对秧苗移栽30 d和150 d的土壤进行速效磷、速效钾、有机质、细菌、真菌和放线菌数量的测定(图3)，采用雷达图对多个指标进行数值分析，面积越大的处理，就表示指标值越好。结果显示，低温复合菌系HT20在5种腐熟剂中效果是较好的。与不添加腐熟剂(CK)和常用腐熟剂相比，低温复合菌系HT20增加了速效磷5.44%～71.49%、速效钾19.62%～56.23%、有机质 6.86%～57.27%、细菌21.29%～76.14%、真菌 1.57%～64.49%、放线菌15.15%～76.14%，表明冀东稻区水稻秸秆还田配施低温复合菌系HT20可以增加土壤的养分含量和微生物数量。

3 讨论与结论

秸秆还田是当今世界上普遍重视的一项培肥地力的增产措施，在杜绝秸秆焚烧所造成的大气污染的同时还有增肥增产作用[24-26]。秸秆还田的效果和秸秆的腐烂速度有直接关系。秸秆腐烂越快对土地的效果越好，而秸秆腐烂的速度除了与自身条件有关以外，还与土壤质地[27]、水热条件[28]和外源氮[29]有很大关系。本研究通过响应曲面法RSM分析得出温度、含水率和低温复合菌系HT20添加量是影响秸秆腐解率的关键因素，原因可能为温度和含水率通过影响土壤中一些微生物群落的生长繁殖和生理机能，低温复合菌系HT20通过直接增加微生物的种类和数量，影响秸秆分解速率。低温复合菌系HT20添加量与温度、含水率的交互作用对秸秆腐解率影响显著，这与以往单一因素对秸秆腐解的研究不同，本研究可同时考虑影响因素单独作用及交互作用对秸秆腐解率影响的显著性。从响应曲面图(图1)中，低温复合菌系HT20添加量与温度、含水率的交互作用对秸秆腐解率的影响过程中，随着HT20添加量的增加，秸秆腐解率出现了拐点，说明HT20添加量与秸秆的腐解效果不是完全成正比，拐点即为最佳添加量。此外，HT20添加量与尿素添加量交互作用对秸秆腐解率影响不显著。因此，在施用HT20时不需额外施用尿素，施用方法简单，这与大多数腐熟剂不同。在我国的北方地区，冬季非常寒冷，微生物活性较低，秸秆2 a不能实现完全腐化，对于下年种植水稻十分不利。本研究从本地水稻秸秆还田土壤中筛选出可在5 ℃生长的纤维素分解菌株，通过低温胁迫、富集筛选、拮抗试验、组合构建了主要由白蚁菌、长柄木霉、芬莱氏链霉菌、葡萄球菌等组成的低温复合菌系HT20，并应用水稻秸秆还田研究中，与不添加腐熟剂(CK)和常用腐熟剂相比，低温复合菌系HT20不仅提高秸秆的腐解速率，缩短腐解时间，同时还增加土壤的养分和微生物数量。利用Design-Expert软件对秸秆腐解率的数学模型求极值得知HT20在5～10 ℃时候的腐解率可达22.6%～36.7%，说明低温复合菌系HT20可以在低温条件下氧化外源物质，降低微生物的启动温度，在水稻秧苗移栽前即可完成秸秆部分分解，释放养分，减少对水稻根系生长的影响。依据该地区气候条件可知，冀东稻区在11月左右水稻收获后施用低温复合菌系HT20直接还田，并进行适量灌水处理，可以满足秸秆腐解需要的温度、水分和微生物，还可以消灭越冬害虫，为解决冀东稻区冬季秸秆原位还田腐解困难问题提供技术支撑。