RCN2在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

徐瑾，周文波，武伦，方大正

(锦州医科大学国药东风总医院研究生培养基地；湖北医药学院附属国药东风总医院，湖北 十堰 442000)

甲状腺乳头状癌(PTC)是一种内分泌系统肿瘤，约占甲状腺癌病人的90%以上，是最常见的分化型甲状腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)类型[1-2]。目前甲状腺癌主要是通过体检或者有症状时被发现，以手术治疗为主[3]。该病程进展缓慢，但仍然有部分患者被发现时已出现远处转移，失去了最佳治疗时机预后较差。

研究发现，RCN2可正向调控肿瘤细胞的生长和侵袭转移[4]，如乳腺癌、结直肠癌、肝癌等中均有报道[5]，作为一种钙离子结合蛋白，特异性定位于内质网[6](endoplasmic reticulum，ER，也被称为ERC-55)中，约由1900个碱基的mRNA编码而成，参与细胞分化和内分泌调节等作用。目前已知哺乳动物体内RCN有3种，研究发现，RCN-2在单纯乳腺癌组织中表达明显升高[6]，在乳腺癌合并甲状腺癌组织中表达下降[7]，这提示RCN2与甲状腺癌相关，但是其在甲状腺癌中表达作用研究较少。因此，本研究通过检测RCN2在甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中的表达情况，并分析其异常表达的临床意义，为甲状腺癌发生发展机制提供一定的理论依据，为临床提供潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料

收集2018年11月至2020年1月就诊于国药东风总医院甲状腺外科经手术切除的65例甲状腺乳头状腺癌组织和配对的癌旁组织(距离肿瘤≥1 cm)，然后立即将新鲜组织样本储存于-80 ℃冰箱。入选标准：经超声、喉镜、肿瘤标志物、穿刺细胞学以及病理学检查等确诊为甲状腺乳头状腺癌。排除标准：术前未经放疗和化疗以及免疫治疗；合并有其他恶性肿瘤、动脉粥样硬化等[8]疾病。手术前均告知患者并签署知情同意书，并获得本医院伦理委员会批准。

患者包括<45岁者12例，≥45岁者53例；男22例，女43例，年龄26～73岁，平均年龄(47.55±10.96)岁；肿瘤直径<1 cm者48例，≥1 cm者17例；肿瘤单发的有38例，多发的27例；病理分期Ⅰ～Ⅱ期者49例，Ⅲ～Ⅳ期者16例；颈部淋巴结转移者20例，无淋巴结转移者45例。

1.1.2 主要试剂

一抗：RCN2 Rabbit Polyclonal antibody，批号：10193-2-AP，100 μL；二抗：HRP-Goat Anti-rabbit IgG，批号：ANT020，50 μL；内参：GAPDH Polyclonal Antibody，批号：YM3215，100 μg；ECL显色试剂盒，批号：WBKLS100，100 mL均购于安特捷生物技术有限公司。全蛋白提取试剂盒购于凯基生物技术有限公司，批号：KGP250，50tests；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购于上海翊圣生物科技有限公司，批号：20201ES76，500T；电泳仪型号：MINIVEPS2A200；凝胶成像系统型号：UPVINC。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色法

术中采集所有患者的部分甲状腺癌组织及癌旁正常组织标本，在病理科医生的配合下进行免疫组织化学染色，具体操作如下：用浓度为10%的福尔马林溶液固定标本，经脱水、石蜡包埋，将蜡块标本行3 μm厚度连续切片；烤片2 h，用二甲苯进行2次变性，各5 min；将载玻片转移至100%、95%、80%、60%的酒精和双蒸水各5 min；将载玻片放置在装有柠檬酸的容器中，进行热修复，后使其在室温下冷却；用PBS冲洗3个3 min，使用H2O2于室温条件下孵育10 min；用PBS冲洗3个3 min；将一抗稀释(浓度在1∶1000)滴加在载玻片上，4 ℃孵育过夜；用PBS冲洗3个3 min；加二抗(TBST稀释，浓度1∶1000)后于常温条件下孵育30 min；用PBS冲洗3个3 min，在室温下用显色剂(DAB)显色8 min，用mayor’s苏木素复染5 min，用清水冲洗2～3次；分别用60%、80%、95%、和100%的酒精脱水，封片。阴性对照为使用PBS溶液(浓度为0.01 mol/L)替代一抗，阳性对照选用已知的阳性标本切片。

结果判断:RCN2蛋白主要定位于细胞质，免疫组化中以细胞质黄染为阳性。根据阳性细胞百分比和染色强度进行评分，由2位病理专业医师进行双盲独立评分，随机观察5个视野，计算阳性细胞百分比评分：0分，0～9%；1分，10%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%。染色强度评分：0分，无染色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，深棕色。计算阳性细胞百分比评分与染色强度评分的乘积，最终免疫评分得分在0～12之间，总得分为4个等级：0为阴性(-)，1～4为弱阳性(+)，5～8为阳性(++)，9～12为强阳性，根据免疫组织化学评分结果将患者分为高低表达两组，其中≤4分为低表达，>4分为高表达组。

1.2.2 蛋白质印迹法

术中采集所有患者的部分甲状腺癌组织及癌旁正常组织标本，具体操作如下：取相同质量的癌和癌旁组织，剪成碎末，按照全蛋白提取试剂盒的要求配液、混合、研磨，注意低温操作，将组织匀浆液转移到1.5 mL预冷的离心管中，离心12 000 g，4 ℃离心5 min，取上清液即为全蛋白提取物。蛋白定量(Bradford法、BCA法)，分装保存于-80 ℃，避免反复冻融。上样前加入5× SDS上样缓冲液，量为分装蛋白样品的1/4，混匀，100 ℃加热5 min，冷却后可放置冰上保存待用或放入-80 ℃保存。验漏、制胶、上样，第1个槽加入5 μL marker用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，随后按照癌、癌旁的顺序，每个槽的蛋白质量保证在30 μg，电泳50 V、3 h左右，转膜200 mA、1.5 h，转膜后TBST洗2次，一次5 min，牛奶封闭1 h，封闭后加一抗和内参GAPDH(2 μL的一抗配2 mL牛奶，0.4 μL内参配2 mL牛奶)，4°过夜，TBST洗3次，每次10 min，孵二抗(1 μL二抗配10 mLTBST)，1 h后用TBST洗3次，分别10、10、15 min，ECL显色，凝胶成像系统采集图像；通过Image J分析灰度值，并利用GraphPad Prism 8对实验数据进行绘图。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 免疫组织化学染色法

65例甲状腺乳头状癌患者中，RCN2蛋白在癌组织中的高表达率为69.23%(45/65)，明显高于癌旁正常组织的18.46%(12/65)，差异有统计学意义(χ2=34.023，P<0.001)，RCN2使用免疫组织化学法在癌组织与癌旁组织中的典型表达，见图1。

a.HE染色100倍显微镜下的癌组织；b.HE染色100倍显微镜下的癌旁组织；c.免疫组化200倍显微镜下的癌组织，以细胞质黄染为阳性；d.免疫组化200倍显微镜下的癌旁组织

2.2 蛋白质印迹法

65例甲状腺乳头状癌患者中，RCN2在癌组织中的表达明显高于癌旁组织(RCN2的分子量是55KD，GAPDH的分子量是36KD)，差异有统计学意义(t=27.665，P<0.001)，见图2、图3。

图2 RCN2蛋白表达条带

图3 RCN2蛋白的灰度比值

2.3 RCN2表达与PTC临床病理因素

RCN2表达与PTC临床病理因素之间的联系，见表1。

表1 RCN2表达与PTC临床病理因素之间的联系

3 讨 论

近些年来，随着医疗水平的提高，人们对体检越来越重视，高分辨率超声(US)的运用使得甲状腺结节的随机检出率高达76%[9]。资料显示恶性结节超声体征：纵横比A/T>1，形态不规则，边界不清，无声晕，内部回声较复杂，微钙化，中央型血流分布[10]，且病理结果也证实甲状腺癌居多，其中PTC的比例最大。据统计，2018年全球新增甲状腺癌病例567 233例[11]，虽然PTC预后和总生存时间明显得到改善[12]。但仍然有部分患者因病灶较小且隐匿，很难在早期被发现，常出现淋巴结转移甚至远处转移致总体生存率较低[13]。因此探索PTC发生发展机制，寻找新的生物靶标尤为重要。研究发现，作为同一家族RCN中的RCN1蛋白，在结直肠癌[14]、乳腺癌[15]中均高表达，调控肿瘤的发生发展，有望成为其潜在的生物标志物；RCN3蛋白在肺癌发生、侵袭调控中也扮演了重要角色，可作为肺癌的生物标记物[16]。RCN2是与钙离子结合的蛋白，存在于细胞内液中，参与细胞内的信号转导[17]，在PTC中表达情况怎样，是否参与肿瘤的发生发展，与患者病理特点之间的关系如何，能否成为调控甲状腺乳头状癌生物学行为的关键蛋白和治疗靶点，是本研究的主要目的。

本研究结果显示，在甲状腺乳头状癌组织中RCN2蛋白的表达水平高于癌旁组织，提示在癌细胞中RCN2存在异常表达，且这种高表达可能与疾病的发生、发展存在着某种因果联系。研究也发现，RCN2在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，是EGFR-ERK信号通路正向调控因子，与PEAK1协同通过激活EGFR-ERK信号通路实现结直肠癌侵袭迁移[18]；肝细胞癌的研究中也发现其在癌组织中的表达明显增加，在信号机制上，RCN2与表皮生长因子受体(EGFR)相互作用，通过调节EGFR-ERK通路来激活肝癌的生长与侵袭[19]。由此推测，RCN2可能通过调节EGFR-ERK通路潜在地促进肿瘤细胞增殖和生长，介导肿瘤的进展。

病理特征相关性研究中发现，病人年龄≥45岁，肿瘤直径≥1 cm，和肿瘤数量≥2个、临床分期Ⅲ和Ⅳ期、有淋巴结转移的患者癌组织中RCN2表达水平也越高，表明了RCN2与甲状腺肿瘤恶化进展程度的正相关性。美国癌症联合会将年龄>45岁作为甲状腺癌患者淋巴结转移及术后复发的危险因素[20]。按照国际抗癌联盟提出的TNM分期法，淋巴转移，TNMⅢ、Ⅳ期预后较差；多灶性甲状腺癌也被称为不良预后的危险因素[21]。此外，已报道结直肠癌中RCN2蛋白阳性表达也提示预后较差[18]2299-2303，由此推测RCN2 可能促进了肿瘤的增殖、转移，影响着患者的预后，可成为甲状腺恶性肿瘤的诊断与预后评判遴选的指标之一。

综上所述，本实验研究中发现RCN2在甲状腺乳头状癌组织中表达较癌旁明显升高，且与肿瘤的发生、发展、预后密切相关，其可为甲状腺乳头状癌的生物学标志以及潜在治疗靶点提供科学依据，但单一标志物无法对甲状腺癌的诊断和预后做出准确判断，临床医师在甲状腺癌诊断、及预后评估中需全方位考虑。本实验不足之处在于研究对象数量相对不足，病理特征相关因素、数据相对较少，未跟踪患者预后，这些在后期将继续研究。