基于网络药理学探讨温胆汤治疗哮喘作用机制∗

杨 阳 张 迪 王 佳 黄程程 王有鹏

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001）

哮喘是儿童最常见的慢性呼吸系统疾病，其特征是慢性气道炎症、可逆性气道阻塞、气道重塑、黏液分泌增加和气道高反应性［1］。哮喘发作的常见诱因包括病毒感染、暴露于过敏原和（或）污染物、吸烟、突然的温度变化、压力和运动等［2-3］。目前，全球约有3.34亿人和10%的儿童受到影响，构成了严重的全球健康问题［4-6］。近年哮喘的发病率不断上升，预计2025年可达4亿［7-8］。中医中药治疗儿童疾病优势近年来受到重视，很多学者也开始深入研究经典方剂治疗哮喘的作用机制，不但可以更好地治疗疾病，还为医学研究提供理论基础。

温胆汤最早记载于南北朝时期医家姚僧垣的《集验方》［9-10］，不同医家对其方义阐释不同，主要包括清热化痰、解郁化痰、达胆和胃、和胃降胆以及分消走泄等功效。现代医家对温胆汤的应用非常广泛，尤其在治疗儿童疾病中应用越来越多，对过敏性疾病的防治效果颇佳，已有临床观察证实温胆汤加减可以治疗儿童哮喘。有关实验对温胆汤中的成分进行测定，发现其中有部分成分可以用于治疗哮喘［11］。笔者通过网络药理学对温胆汤主要成分治疗哮喘进行探讨，通过构建网络，获得温胆汤治疗哮喘可能的作用机制，为后续实验研究提供理论依据。

1 研究方法

1.1 获取温胆汤中主要中药有效成分及药物靶点使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）筛选温胆汤中主要药物的活性化合物，分别输入“半夏”“陈皮”“茯苓”“枳实”，筛选标准为：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug like，DL）≥0.18。

1.2 检索哮喘靶点基因 分别在Gene Cards（https：//www.geneca-rds.org/）和在线人类孟德尔遗传（OMIM，https：//omim.org/）中输入“asthma”进行检索，并将两个表格进行整合。

1.3 温胆汤药物活性成分-核心靶点网络和PPI网络构建 将“1.1”获得的温胆汤主要药物的活性成分及核心靶点相关信息导入Cytoscape 3.6.1软件，绘制温胆汤活性成分-核心靶点网络。使用STRING平台（https：//string-db.org/）可以构建蛋白互作网络。

1.4 GO分析 使用R语言软件对温胆汤主要药物与哮喘的共作靶点进行数据的处理，并得到GO分析的条形图、气泡图。使用Perl将转换的ID变成原始基因靶点。

1.5 KEGG通路富集分析及KEGG关系网络构建 将获得的ID转换文本文件，运行R语言得到KEGG通路富集分析的条形图、气泡图及文本文件。使用perl对获得的KEGG文本文件进行操作，输入Cytoscape 3.6.1软件，绘制温胆汤与哮喘直接的KEGG关系网络。

2 结 果

2.1 温胆汤主要药物的活性成分 经过TCMSP筛选后得到温胆汤主要药物的有效活性成分52个，其中半夏13个，陈皮5个，茯苓15个，枳实22个，陈皮、枳实共有3个，整合后可获取药物有效活性成分作用靶点603个。

2.2 潜在靶点信息 通过Gene Cards获得哮喘的靶点基因5 974个，通过OMIM获得哮喘靶点基因36个，将已经获得的温胆汤中活性成分作用的靶点基因取交集，可获得两者的共同靶点有131个。

2.3 温胆汤主要药物中活性成分-核心靶点网络 应用Cytoscape 3.6.1软件，绘制温胆汤主要药物活性成分-核心靶点网络（如图1），三角形代表靶点，椭圆形代表活性成分，其中蓝色代表半夏，绿色代表陈皮，紫色代表茯苓，黄色代表枳实，红色代表多味药共同含有。连线越密集的节点越重要。将获得的131个靶点输入STRING数据库，构建PPI网络，见图2，并运用R语言提取PPI网络中度值中心性较高的前30位的核心基因，见图3。

图1 温胆汤主要药物中活性成分-核心靶点网络

图2 温胆汤与哮喘靶点PPI网络

图3 PPI的核心基因

2.4 GO富集分析 分析经R语言运行后总共得到135个功能，获取其中前20个的GO功能富集的条形图和气泡图（见图4、图5）：富集越是显著颜色越偏红色，富集越少颜色越偏蓝色；横坐标表示富集数目。

图4 温胆汤治疗哮喘候选靶点的GO富集条形图

图5 温胆汤治疗哮喘候选靶点的GO富集气泡图

2.5 KEGG通路富集分析及KEGG关系网络构建 使用R语言软件对获得的131个靶点基因进行KEGG通路富集分析，运行后得到30条通路。绘制显著性前20的通路的条形图和气泡图（见图6、图7）：横坐标表示靶点数，左边表示通路名称，通路上靶点数越多颜色越偏红色，靶点数越少颜色越偏蓝色。通过对富集前20的KEGG通路与基因之间的网络图（见图8）：三角形代表通路，椭圆形代表基因，线代表相互链接，图形越大代表相互关联数量越多。

图6 温胆汤-哮喘潜在靶点KEGG通路条形图

图7 温胆汤-哮喘潜在靶点KEGG通路气泡图

图8 温胆汤治疗哮喘的KEGG关系网络

3 讨 论

哮喘可归为中医学的“哮证”“喘证”等范畴。在《素问·阴阳别论》中“阴争于内，阳扰于外，魄汗未藏，四逆而起，起则熏肺，使人喘鸣”，对哮喘的病因和症状进行描述。后世《金匮要略》“咳而上气，喉中水鸡声”，进一步对症状及治疗进行记载。近现代中医学者对哮喘的认识更深入，对病因病机的不断完善，治疗上面的选方用药更系统化、多样化、全面化。通过温胆汤加味治疗哮喘的临床观察可以看出，其治疗哮喘具有一定的疗效，但是对于机制的研究尚未广泛开展。

通过对温胆汤中的有效成分进行分析，部分化合物已经证实具有治疗哮喘的作用，尤其是一些与基因关联较多的活性成分，比如木樨草素、β-谷甾醇、柚皮素、豆甾醇等。木樨草素具有抑制哮喘气道重塑及抑制哮喘气道炎症的作用［12］。β-谷甾醇具有抑菌抗炎的作用，多个治疗哮喘的药物都含有此成分［13-14］。柚皮素具有止咳化痰平喘的作用［15］。豆甾醇对哮喘气道炎症具有调节作用［16］。

通过对温胆汤与哮喘的PPI网络分析，核心基因为Akt1、MAPK3、IL-6、VEGFA、FOS、JUN、MAPK1等。查阅文献可知，AKT1的磷酸化变化可能在治疗哮喘的疗效中起重要作用［17］。MAPK3与MAPK1在MAPK信号通路中具有重要的作用，与调控气管平滑肌细胞炎症基因表达的重要信号酶相关［18］，MAPK信号通路与温胆汤治疗哮喘也具有相关性。IL-6近年被证实是哮喘的易感基因［19-20］。VEGFA在哮喘发病中起作用，如嗜酸性炎症、杯状细胞化生、气道重塑以及气道高反应性，被认为是哮喘发病的关键介质之一［21］。FOS与JUN等基因都参与了哮喘的气道炎症、气道重塑和气道高反应等，从而使哮喘诱发或严重［22］。已有文献证明，温胆汤对某些疾病的患者或实验动物血清中的炎症因子IL-6、VEGFA等有调节作用，可调节组织中FOS及JUN等基因的表达。目前关于温胆汤治疗哮喘的动物实验研究较少，分析获得的基因将是后期实验的主要研究对象。

GO富集分析显示GO功能富集后富集数目较多的有泛素样蛋白连接酶结合、DNA结合转录激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性、磷酸酶结合等。真核生物中泛素样蛋白连接酶在许多细胞功能中起着核心作用，但目前针对其与哮喘的研究较少。磷酸酶是许多细胞信号传递的关键，可以激活信号通路，使其表现功能。可推测温胆汤通过参与多途径治疗哮喘，尤其是在细胞免疫等方面。淋巴细胞的失衡是哮喘发病机制的主要原因之一，免疫细胞参与哮喘的发病、发生、发展及治疗。合理选择中药复方可以更好地通过细胞免疫等方面改善哮喘症状，不但使中药治疗疾病效果更佳，还可以通过实验数据使中医药更具有说服力和应用空间。

KEGG富集通路分析显示温胆汤治疗哮喘主要通路有PI3K-Akt信号通路、内分泌抵抗、细胞凋亡、cAMP信号通路等通路为主；KEGG通路与基因之间的网络图中关联数量较多的基因主要有MAPK3、MAPK1、Akt1等。其中，最新研究表明，通过靶向PI3K/Akt整合素轴的气道上皮修复是治疗儿童喘息和哮喘的新途径［23］。哮喘发生主要的因素是气道炎症与气道重塑及气道高反应等，PI3K-Akt通路不但可以减轻气道炎症，还可以抑制气道重塑，从而改善哮喘症状。气道细胞凋亡的积聚可能是导致气道高反应性的重要因素。凋亡细胞能否及时清除与哮喘的发生和病程有关［24］。研究发现，cAMP信号通路在多系统及细胞代谢等方面发挥着重要作用，其中某些基因的异常表达与哮喘病理生理的变化过程具有重要关联［25］。还有文献表明，该通路可能是肺肠同治哮喘的物质基础之一［26］。

本文通过网络药理学对温胆汤治疗哮喘进展分析，推测其可能是通过多成分、多靶点、多通路的相互关系进行作用，可进一步针对其影响气道重塑、信号传导和免疫代谢等方面进行实验证实。温胆汤治疗哮喘的作用机制PI3K-Akt、cAMP等信号通路可能有关，作用于MAPK3、MAPK1、Akt1等相关受体。目前关于其中的机制研究较少，尽管以上结论是通过查阅数据库所得，仍可为科研实验提供了新思路。本次获得信号通路可能就是温胆汤治疗哮喘的主要通路，后期可通过实验对通路及相关因子进行验证，以期为中医药的发展提供更好的基础理论依据，为中医药的蓬勃发展做贡献。