虫草益肾方对肾纤维化大鼠Hippo信号通路表达的影响∗

苑伯菲 宋立群， 代丽娟 于珊珊 贠 捷，△

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040）

慢性肾脏病发展至尿毒症期的根本病理变化为肾脏纤维化，包括肾小球硬化和肾间质纤维化（RIF），其中RIF是其主要病理形态特点。RIF受炎症、氧化应激、自噬、细胞凋亡等多种因素调节，最终导致肾小管上皮细胞转化成为肌成纤维细胞，促进RIF，引起肾功能减退。RIF程度与肾脏功能进展直接相关，目前尚无有效的彻底逆转该过程的方法。Hippo信号通路是调节器官生长和组织大小的信号通路，其生理功能大多通过影响细胞增殖和细胞凋亡实现，因此，它在肾脏发育、肾小管上皮细胞凋亡、上皮细胞间充质转分化（EMT）、组织异常修复等多个环节中发挥着重要的作用。近期研究证明Hippo信号通路与肾脏病如糖尿病肾病、局灶阶段性肾小球肾炎、多囊肾、肾小球基底膜破坏等疾病进展有一定相关性［1］。研究显示虫草益肾方能延缓RIF进展，前期蛋白质组学及网络药理学研究结果提示其机制可能与影响Hippo信号通路相关［2］。通过观察虫草益肾方对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠Hippo通路核心蛋白p-YAP、p-Mst1、p-Lats1及肾小管上皮细胞间充质转分化的标志蛋白α-SMA、E-cadherin表达的影响，从分子水平探究虫草益肾方延缓RIF进展的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康SD雄性大鼠40只，体质量180～220 g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，动物使用许可证号：SCXK（黑）2017-014，实验操作经黑龙江中医药大学实验动物伦理委员会批准，于黑龙江中医药大学临床分子生物学实验室进行实验。

1.2 实验药物 虫草益肾方由黄芪30 g，水蛭10 g，酒蒸大黄15 g，猫须草15 g，冬虫夏草3 g组成。黄芪、水蛭、酒蒸大黄、猫须草购自黑龙江德顺长中药饮片有限公司，冬虫夏草粉由黑龙江中医药大学附属第一医院肾病科提供。将黄芪、水蛭、酒蒸大黄、猫须草煎煮2次，合并滤液，加入冬虫夏草粉搅拌均匀，再在旋转蒸发仪中缓慢蒸发，水浴浓缩至质量浓度为0.657 g/mL，高压灭菌，得虫草益肾方水煎液，密封储存于4℃冰箱内备用。咪达普利（达爽），天津田边制药有限公司生产。

1.3 试剂与仪器 Masson三色染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，YAP（D8H1X）XP Rabbit Mab 14074、Phospho-YAP（Ser109）（E519G）Rabbit Mab 53749、LATS1（C66B5） Rabbit mAB3477、Phospho-LATS1（Ser109）Antibody 9157、MST1（D8B9Q）Rabbit mAb 3477、GAPDH（D16H11）XP Rabbit mAb 5174抗体试剂盒均购于美国CST公司；AntiE-Cadherin（ab231303）购于美国艾博抗公司；Western blotting一抗稀释液（M3001），哈尔滨新海基因检测有限公司。旋转蒸发器（RE-52 CS），上海亚荣生化仪器厂；生物显微镜（BX41），奥林巴斯（中国）有限公司；病理切片机，赛默飞世尔科技公司；数字病理切片扫描系统（SCN400），德国徕卡；超低温冷冻存储冰箱（DW-HL340），中科美菱低温科技股份有限公司；转膜电泳槽（VE 186），天能电池集团股份有限公司；高速冷冻离心机（LC-LXHRF210 E）。

1.4 模型制备［3-5］40只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组、模型组、咪达普利组、虫草益肾方组，每组10只。适应性喂养1周后，禁食禁水12 h后，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉。碘伏消毒，无菌手术环境中打开腹腔，假手术组随后即缝合腹腔，模型组、咪达普利组、虫草益肾方组在左后腹壁找到白色细线状输尿管并游离，在肾盂处及输尿管上1/3处分别用手术线结扎，两处结扎中间位置剪断输尿管，少量青霉素药粉局部给药，最后缝合腹部皮肤，UUO模型制作完毕，单笼饲养24 h，正常喂养。

1.5 给药方法 虫草益肾方成人每日服药量为73 g，根据人-鼠体表面积换算方法计算，实验大鼠每日给药量为6.57 g/kg。虫草益肾方组采用虫草益肾方水煎液灌胃，假手术组、模型组采用生理盐水灌胃，每日剂量为10 mL/kg体质量。咪达普利组采用咪达普利水溶液灌胃，每日剂量为0.45 mg/kg体质量。各组均连续给药14 d。实验过程中观察大鼠的精神状态、活动情况、皮毛光泽度等一般情况。

1.6 标本采集与检测 给药结束后禁食12 h，禁水1 h，置于无菌条件下以10%水合氯醛0.3 mL/100 g右上腹腔注射麻醉大鼠，行腹正中线纵行切开。下腔静脉采血后，用生理盐水从左心房注入，直至大鼠双肾变为苍白色，快速剥离梗阻侧肾脏。将肾脏沿肾门分成两部分，一部分放入液氮用于Western blotting检测，另一部分用于病理学染色。检测项目：1）血清肌酐（Crea）、尿素氮（BUN）。全自动生化分析仪对大鼠血清Crea、BUN进行检测。2）肾脏组织形态学检查。肾组织用石蜡包埋后制备切片，铁苏木素染色后分化，冲洗。Masson返蓝，冲洗。使用品红、磷钼酸、甲苯胺蓝染色，冲洗，脱水，封片，于显微镜镜下（400倍）观察组织形态。使用Imagej软件计算组织纤维化比例。3）肾组织YAP、p-YAP、MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、α-SMA、E-cadherin蛋白的表达。取肾脏组织冰上剪碎后、裂解，BCA法测定总蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，转膜，加入稀释一抗的Phospho-MST1、MST1、Phos⁃pho-LATS1（Ser909）、LATS1、Phospho-YAP（Ser109）、YAP、GAPDH、α-SMA、E-cadherin抗体，孵育过夜，洗膜后加入二抗，孵育1 h。ECL显影，凝胶成像系统分析目的蛋白的相对表达量，目标蛋白表达量通过GAPDH进行校正。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 假手术组大鼠体质量较造模前增加，精神状态好，动作敏捷，毛发光亮。模型组、咪达普利组、虫草益肾方组大鼠体质量减少，精神萎靡，动作迟缓，皮毛干枯，无死亡。

2.2 各组大鼠血清肌酐及尿素氮水平比较 见表1。与假手术组比较，模型组Crea、BUN明显升高（P<0.05）；与模型组比较，咪达普利组、虫草益肾方组BUN明显下降（P<0.05）；咪达普利组与虫草益肾方组Crea、BUN无明显差异。

表1 各组大鼠血清肌酐、尿素氮水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清肌酐、尿素氮水平比较（±s）

注：与假手术组比较，▲P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。下同。

组别假手术组模型组咪达普利组虫草益肾方组n 10 10 10 10 Crea（μmol/L）25.07±4.51 40.55±4.62▲38.55±3.67▲38.31±2.82▲BUN（mmol/L）6.04±0.46 11.98±1.51▲8.18±0.72#▲7.97±1.02#▲

2.3 各组大鼠肾组织病理及纤维化面积的比较 见图1，表2。Masson染色下评估肾组织RIF程度，假手术组肾间质见极少量胶原，未见空泡。模型组肾间质可见胶原沉积明显增多，炎症细胞浸润，小管上皮细胞出现空泡变性等现象。咪达普利组与虫草益肾方组局部肾间质胶原沉积明显少于模型组，少见空泡。与假手术组比较，模型组纤维化面积明显升高（P<0.05）；与模型组比较，咪达普利组、虫草益肾方组纤维化面积明显下降（P<0.05）；咪达普利组与虫草益肾方组纤维化面积无明显差异。

表2 各组大鼠肾间质纤维化面积比较（%±s）

表2 各组大鼠肾间质纤维化面积比较（%±s）

n组别假手术组模型组咪达普利组虫草益肾方组10 10 10 10纤维化面积22.09±0.33 24.68±2.29△18.21±1.42*△17.32±1.36*△

图1 各组大鼠肾组织病理变化（Masson染色，400倍）

2.4 各组大鼠肾脏组织MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP及α-SMA、E-cadherin蛋白表达比较 见图2～图3，表3～表5。与假手术组相比，模型组 p-MST1、p-LATS1、p-YAP 蛋白表达下调，MST1、LATS1、YAP蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），α-SMA蛋白表达上调，E-cadherin蛋白表达下调。与模型组相比，咪达普利组、虫草益肾方组p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表达上调，MST1、LATS1、YAP蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），α-SMA蛋白表达下调，E-cadherin蛋白表达上调。说明单侧输尿管梗阻造模能减少Hippo通路中磷酸化MST1、LATS1、YAP蛋白的表达，减少α-SMA蛋白的表达，增加E-cadherin蛋白的表达，虫草益肾方和咪达普利能增加大鼠磷酸化MST1、LATS1、YAP蛋白的表达，增加α-SMA蛋白的表达，减少E-cadherin蛋白的表达。与咪达普利组比较，虫草益肾方组MST1、LATS1、YAP蛋白表达无明显差异。

图2 各组大鼠肾组织MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP电泳条带

图3 各组大鼠肾组织α-SMA、E-cadherin电泳条带

表3 各组大鼠肾脏组织MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠肾脏组织MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP蛋白表达比较（±s）

组别假手术组模型组咪达普利组虫草益肾方组n 10 10 10 10 p-MST1/GAPDH 0.97±0.17 0.18±0.04▲0.42±0.08#0.51±0.12#p-LATS1/GAPDH 0.81±0.13 0.32±0.09▲0.48±0.11#0.54±0.14#p-YAP/GAPDH 0.78±0.12 0.22±0.06▲0.39±0.11#0.43±0.13#MST1/GAPDH 1.12±0.21 1.16±0.19 1.08±0.19 1.17±0.20 LATS1/GAPDH 1.01±0.21 1.06±0.17 0.97±0.15 1.02±0.23 YAP/GAPDH 0.89±0.11 0.90±0.15 0.88±0.15 0.93±0.17

表4 各组大鼠肾组织p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白与总蛋白比较（±s）

表4 各组大鼠肾组织p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白与总蛋白比较（±s）

组别假手术组模型组咪达普利组虫草益肾方组n 10 10 10 10 p-MST1/MST1 0.87±0.15 0.16±0.05▲0.39±0.11#0.44±0.14#p-LATS1/LATS1 0.81±0.12 0.30±0.09▲0.49±0.12#0.53±0.11#p-YAP/YAP 0.88±0.13 0.24±0.07▲0.44±0.12#0.46±0.15#

表5 各组大鼠肾组织α-SMA、E-cadherin蛋白表达比较（±s）

表5 各组大鼠肾组织α-SMA、E-cadherin蛋白表达比较（±s）

组别假手术组模型组咪达普利组虫草益肾方组n 10 10 10 10 α-SMA 0.19±0.05 0.93±0.15▲0.44±0.12#0.37±0.11#E-cadherin 0.89±0.16 0.21±0.03▲0.50±0.06#0.55±0.11#

3 讨 论

中医学将RIF归属于“虚劳”“腰痛”等疾病范畴，其发病机制主要是脏腑虚损，兼有血瘀、浊毒，应治以补益脏腑、活血化瘀、泻浊解毒。虫草益肾方是宋立群教授治疗CKD的经验方，由冬虫夏草、猫须草、黄芪、水蛭和酒蒸大黄组成，全方补益脏腑、活血化瘀、泻浊解毒。虫草益肾方中冬虫夏草、黄芪为君药，温补诸脏腑。冬虫夏草能调控Notch、AMPK等纤维化相关信号通路，减少细胞外基质积聚，抑制EMT，延缓肾间质纤维化［6-8］。黄芪通过调节TGF-β信号通路，以减轻细胞凋亡，并直接作用于成纤维细胞，抑制 EMT，进而减轻 RIF［9-10］。方中臣以酒蒸大黄、水蛭、猫须草活血化瘀、泻浊解毒。大黄入血分，能活血化瘀，入气分，则泻浊解毒，酒蒸减轻其苦寒泻下作用。大黄有效成分为大黄素、大黄酸等，通过抑制肾小管上皮细胞凋亡、抑制EMT，影响MAPK、HIF1α/VEGF/PDGFR-α、PI3K/Akt等信号通路，减轻RIF［11］。水蛭为虫类药，破血化瘀止痛，尤善走窜通络。实验表明［12-13］水蛭可能通过调节KIM-1、ICAM-1减轻炎症反应，抑制TGF-β1，减轻单侧输尿管梗阻大鼠RIF程度。猫须草又名肾茶，有利水功效，现代药理实验发现有抗氧化应激、抑制肾小管及肾间质成纤维细胞生长因子表达等作用，表明猫须草对慢性肾衰竭大鼠肾脏具有保护作用［1，14］。虫草益肾方在保护慢性肾脏病患者肾脏功能，延缓RIF等方面疗效确切［15］。

前期研究发现慢性肾衰患者服用虫草益肾方可降低血清中Crea及BUN等毒素含量，明显缓解乏力、食欲下降、皮肤瘙痒等症状［16］。研究发现14 d时大鼠血液中Crea及BUN含量明显降低，差异有统计学意义，与前期临床研究结果相符。染色后，镜下观察肾组织改变是评价肾组织结构病理改变最直观的方法，Masson染色结果较为适合观察肾间质纤维化，因此选用Masson染色。与假手术组相比，模型组肾间质可见胶原沉积明显增多，小管上皮细胞出现空泡变性等现象，提示肾间质纤维化模型造模成功。与模型组比较，咪达普利组与虫草益肾方组局部肾间质胶原沉积明显少于模型组，少见空泡，说明咪达普利及虫草益肾方均能减轻UUO大鼠肾间质纤维化。RIF过程中，REC被破坏，细胞经重塑和表型改变，转分化为成纤维细胞，参与器官纤维化过程［17］。E-cadherin是REC标志蛋白，α-SMA是肌成纤维细胞的特征蛋白［18］。Western blotting结果显示，与假手术组相比，模型组、咪达普利组、虫草益肾方组α-SMA蛋白表达上调、E-cadherin蛋白表达下调，提示REC转化为成纤维细胞，RIF进行性发展。与模型组比较，咪达普利组、虫草益肾方组α-SMA蛋白表达下调，E-cadherin蛋白表达上调，提示咪达普利、虫草益肾方通过减少REC转化为成纤维细胞，延缓RIF进展。

Hippo信号通路参与肾间质纤维化进程，有研究［19］将小鼠YAP基因敲除，代表纤维化细胞分化能力的α-SMA蛋白表达相应降低，说明Hippo信号通路与纤维化密切相关。在对其他动物模型的研究中也发现Hippo信号通路的表达被抑制后，能明显延缓RIF的进展［20］。Hippo信号通路是由Mst激酶、Lats激酶与YAP组成的三步激酶级联，也是该信号通路中的核心组分，在正常情况下，活化的MST可以磷酸化并激活其底物LATS，进而直接引起下游YAP的磷酸化，p-YAP留存于细胞质中，进一步被降解，无法进入细胞核。当Hip⁃po信号通路被抑制时，磷酸化YAP表达被抑制，去磷酸化的YAP表达增加并进入细胞核，在肾脏细胞核内高表达，进一步激活下游PI3K/Akt、TGF-β/Smad等信号通路，使肾脏发生异常的增殖和修复，诱导EMT的发生，介导细胞外基质积聚，影响RIF的进展［21-22］。本研究Western blotting结果显示，与假手术组相比，模型组 p-MST1、p-LATS1、p-YAP 蛋白表达下调，MST1、LATS1、YAP蛋白表达基本不变，α-SMA蛋白表达上调，E-cadherin蛋白表达下调。说明在UUO制备的肾间质纤维化模型大鼠中Hippo信号通路中MST1、LATS1与YAP组成的激酶级联磷酸化过程受到抑制，与模型组相比，咪达普利组、虫草益肾方组p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表达上调，MST1、LATS1、YAP蛋白表达基本不变，α-SMA蛋白表达下调，E-cadherin蛋白表达上调。说明虫草益肾方和咪达普利能上调UUO大鼠血清中磷酸化MST1、LATS1、YAP蛋白的表达水平。

本研究表明Hippo信号通路与RIF的发生发展密切相关，与既往研究相符［23］。虫草益肾方能下调UUO大鼠梗阻侧肾组织α-SMA蛋白表达水平、上调E-cad⁃herin蛋白表达水平，抑制EMT，延缓RIF进展，其作用机制可能与上调MST1、LATS1、YAP蛋白磷酸化水平，调节Hippo信号通路相关。后期本课题组将进一步探究Hippo信号通路在RIF进程中不同时间点的动态变化及YAP蛋白在细胞质、细胞核中的分布情况，以明确Hippo信号通路在RIF整体进程中的作用，以及虫草益肾方对Hippo信号通路产生影响的作用机制。