茶树油对LPS诱导的奶牛乳腺炎的作用及其机制

2021-07-30陈志张逸路钦越郭佳禾梁艳张明怡星杨章平

中国农业科学 2021年14期

陈志，张逸，路钦越，郭佳禾，梁艳，张明怡星，杨章平

陈志，张逸，路钦越，郭佳禾，梁艳，张明怡星，杨章平

扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009

【】奶牛乳腺炎一直是奶牛养殖业和奶制品行业最大的挑战之一，制约着奶业的健康发展。有效进行奶牛乳腺炎的防治，可以为奶牛的健康、生产优质乳制品提供良好保障。探究茶树油对LPS诱导的奶牛乳腺炎作用效果，探索茶树油替代抗生素治疗奶牛乳腺炎的可行性，为茶树油治疗奶牛乳腺炎提供参考。在牛乳腺上皮细胞的培养中分别添加50、100、200、500、1 000μg·mL-1的LPS进行相关指标的检测。通过CCK-8法检测细胞增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡、实时荧光定量检测细胞因子表达量以及ELISA检测相关蛋白的表达量等方法检测乳腺上皮细胞的相关指标。研究构建了LPS诱导的奶牛乳腺炎模型。在200μg·mL-1LPS诱导12h的奶牛乳腺炎细胞模型中分别添加0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%的茶树油进行相关指标的检测。CCK-8法检测细胞增殖活性，结果显示100μg·mL-1的LPS攻毒情况下，细胞已开始出现不同程度的活性下降情况。进一步使用流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果显示在诱导12h的情况下，100μg·mL-1的LPS并未出现大量的细胞凋亡，而200μg·mL-1的LPS诱导情况下约有46%左右的细胞出现了早期凋亡和晚期凋亡。以上结果表明：试验中，200μg·mL-1LPS诱导12h为构建奶牛乳腺炎模型的最佳条件。添加茶树油浓度为0.0004%、0.0006%、0.0008%时细胞的凋亡比例会有所下降，其中添加茶树油浓度为0.0006%的这一组保护效果最为明显，其活细胞比例71.95％，早期凋亡细胞比例22.15％，晚期凋亡细胞比例5.11％，与未添加茶树油的乳腺炎模型组活细胞相比提高了约22%。之后对有保护效果的3组进行qPCR检测细胞因子与凋亡因子表达量，结果显示随着加入茶树油的浓度上升，TNF-α表达量下调的较多，IL-6的表达量下调的较少（＜0．01），STAT1的表达量在加入0.0004%浓度茶树油时有轻微的上调，在0.0006%和0.0008%浓度时表达量略微下调，其中添加0.0006%浓度茶树油表达量最低（＜0.05）。进一步使用ELISA法检测炎症蛋白和凋亡蛋白表达量，结果显示3组浓度的茶树油添加组均极显著降低了NF-κB、MAPK和Caspase-3的表达量，其中，0.0006%浓度茶树油组较其余浓度组的炎症反应蛋白的表达量最低，约为空白对照组的50%（＜0.05），而这3组的凋亡反应相关蛋白表达量则几乎持平，约为空白对照组的55%（＜0.05）。茶树油对于奶牛乳腺炎有一定的拮抗作用，可以降低细胞凋亡比例，提高正常细胞的存活比例，并下调炎症因子与凋亡因子以及相应蛋白的表达量。

茶树油；奶牛；LPS；乳腺炎；作用机制

0 引言

【研究意义】乳腺是合成乳汁的主要场所，随着人们营养观念的转变，乳品已成为消费需求的主流[1]。奶牛乳腺炎影响奶牛的健康，制约奶牛业的发展，近期有研究显示，奶牛疾病抗性越强，如奶牛乳房炎和部分繁殖疾病，则长寿性表现越好[2]。因此，奶牛的健康养殖和抗病营养是提高我国奶牛养殖水平、改善奶品质和增强市场竞争力的新型支撑技术[3]。大部分奶牛乳腺炎由病原菌导致，可用抗生素进行治疗。但随着耐药性问题日益突出，如何有效防治奶牛乳腺炎，寻找新的抗菌物质，成为当前奶牛养殖业研究热点。【前人研究进展】奶牛乳腺炎是指由于各种物理、化学、病原菌等因素引起的乳房炎症，导致奶牛乳腺组织发生病理学变化，进而导致所分泌乳汁发生理化性质和细菌学变化[4]。引起奶牛乳腺炎的病因很复杂，但最主要的还是由病原微生物引起，常见的病原菌有20多种[5]，其中以金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和大肠杆菌为主，如李蕊等[6]研究发现金黄色葡萄球菌诱导型乳腺炎影响了奶牛脂肪酸的合成过程，降低了脂肪酸各组分的绝对含量；吴富鑫等[7]也对无乳链球菌在乳腺中的感染和传播的过程进行了讨论。LPS是大肠杆菌等革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一，是导致乳腺炎发病的主要致病因素。国内外研究已经在多种动物上成功构建LPS诱导的乳腺炎模型[8-9]，在大肠杆菌导致的奶牛乳腺炎上，LPS所引起的急性临床指标与乳汁中酶活性和急性期蛋白密切相关[10]。奶牛乳腺炎会导致奶牛产奶量大幅下降，奶品质降低，同时导致奶牛乳腺的伤害。防治奶牛乳腺炎意义非凡，对于奶牛乳腺炎的治疗主要还是使用抗生素，但大部分牛场基本都是在不明确病原菌及抗生素耐药性的情况下滥用抗生素，导致病原菌的耐药及药物残留[11]，进而降低了治疗效果。寻找有效的抗生素替代品进行奶牛乳腺炎的防治成为一项具有重要意义的研究项目。茶树油（tea tree oil，TTO）是指取自于桃金娘科（Myrtaceae）白千层（Melaleuca L.）的数种植物的精油，其中最主要的一种为互叶白千层（M.alternifola），故又称为互叶白千层油。茶树油是许多非处方保健品和化妆品的常用成分，随着天然药物的蓬勃发展，越来越多的人使用含有茶树油的产品[12]。茶树油抗菌谱广、抗菌活性强，故被用于治疗由真菌、细菌或病毒引起的相关疾病，如陈昕等[13]研究发现茶树油提取物粉对大鼠免疫功能有较明显的增强作用，其有望开发成为一种可缓解全球“抗菌药物危机”的天然抗菌剂[14]。【本研究切入点】随着抗生素滥用所导致的耐药性问题，寻找新型有效抗菌物质迫在眉睫。本研究旨在探究茶树油对LPS诱导的奶牛乳腺炎的作用及其机制，探索茶树油替代抗生素治疗奶牛乳腺炎的可行性，为茶树油治疗奶牛乳腺炎提供参考。【拟解决的关键问题】构建LPS诱导的奶牛乳腺炎模型以及茶树油对该乳腺炎模型的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所有的试验于2017年12月至2019年7月在扬州大学动物科学与技术学院进行。

1.1.1 细胞株 Mac-T细胞（乳腺上皮细胞）由扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作实验室提供。

1.1.2 主要试剂茶树油购于上海源叶公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，055:B5）购于 Sigma公司；胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培养基购于 Gibco公司；CCK-8试剂盒购于日本同仁公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购于美国BD公司；实时荧光试剂盒、反转录试剂盒购于南京诺唯赞公司，牛核因子κB（NF-κB）、丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）ELISA 检测试剂盒购于上海侨社公司。

1.2 试验方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的培养 Mac-T细胞（乳腺上皮细胞）使用DMEM/F12培养基，完全培养基成分比例为90% DMEM/F12培养基和10%胎牛血清，37℃培养，CO2浓度为5%，每隔48h更换培养基。用 0.25%胰蛋白酶消化进行传代，倒置显微镜观察细胞生长状况。

1.2.2 LPS诱导的奶牛乳腺炎模型的构建

1.2.2.1 CCK-8法检测LPS诱导下的细胞增殖活性将Mac-细胞的密度调整为1×104个/mL接种96孔培养板中，培养24 h后，弃去培养基，分别加入含LPS50、100、200、500、1 000 μg·mL-1的培养基（不含血清），同时设立不加LPS的对照组和无细胞只加培养液的空白对照组，每组设置3个重复，分别培养4、8、12和24h后，根据CCK-8试剂盒操作步骤检测细胞增殖活性。

1.2.2.2 流式细胞术检测LPS诱导下的细胞凋亡率将Mac-细胞接种于6孔培养板中，培养24 h后，弃去培养基，选择在细胞增殖试验中适宜的LPS浓度和培养时长进行培养，同时设立不加LPS的空白对照组，培养结束时，用PBS清洗并收集细胞，用Buffer调整细胞浓度1×106/100 μL/test；加5 μL Annexin V-FITC 和5μL PI，室温避光20 min；加400 μL Buffer上机检测细胞的凋亡情况。最终依据细胞增殖活性试验和凋亡试验确定构建奶牛乳腺炎模型的最适LPS浓度和作用时间。

1.2.3 茶树油对LPS诱导的奶牛乳腺炎模型的影响

1.2.3.1 茶树油的溶解与配置茶树油由于其易溶于有机溶剂，难溶于水的性质，在培养基中溶解茶树油需要添加一定的增溶剂。研究发现，选取体积分数为1%的DMSO对细胞形态无明显影响，且对于茶树油的溶解具有良好的效果[15]。本实验将茶树油溶于DMEM培养基时，加入1%浓度的DMSO作为增溶剂，配置出0.1%的茶树油溶液的母液，使用时稀释为不同浓度进行试验。

1.2.3.2 流式细胞术检测茶树油对乳腺炎模型的凋亡率的影响试验开始之前，将茶树油溶液的母液稀释成0.0002%—0.01%。试验开始后将Mac-T细胞接种于6孔培养板中，培养24 h后，弃去培养基，加入最适浓度的LPS与不同浓度茶树油溶液进行混合培养，同时设置设立不加茶树油只加LPS的对照组和不加茶树油和LPS只加培养液的空白对照组。培养最适时间后，加入Annexin V-FITC 和PI之后上机检测细胞的凋亡情况，初步确定具有保护作用的适宜茶树油浓度范围。

1.2.3.3 qPCR检测茶树油对乳腺炎模型炎症因子与凋亡因子表达量的影响收集适宜浓度范围内的茶树油与LPS混合培养最适时间的细胞，用 TRIZOL法[16]提取总 RNA，根据反转录试剂盒操作步骤，将RNA反转录成cDNA，使用实时荧光试剂盒进行基因的qPCR检测。各基因表达比较采用β-actin为内参，2-ΔΔCt法分析PCR数据。引物设计见表1。

表1 基因的qPCR引物序列

1.2.3.4 ELISA法检测茶树油对乳腺炎模型炎症蛋白和凋亡蛋白表达量的影响收集适宜浓度范围内的茶树油与LPS混合培养最适时间的细胞，PBS清洗后，加入RIPA裂解液进行裂解，根据ELISA 检测试剂盒操作步骤进行炎症相关的牛核因子κB（NF-κB）、丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）和凋亡相关的胱天蛋白酶-3（Caspase-3）的检测。

1.2.4 统计分析应用 Excel软件整理数据，应用 Graph Pad Prism 5.0软件对试验数据进行统计学分析（one－way ANOVA 或 two－tailed Studen’s t test），其中＜0.05表示差异显著，＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 CCK-8法检测LPS诱导下细胞增殖活性

由表1可知，在100 μg·mL-1的LPS攻毒情况下，细胞已开始出现不同程度的活性下降情况，由于500和1 000 μg·mL-1LPS诱导的细胞活性太低，所以选择100或200 μg·mL-1LPS培养12 h作为下一步凋亡试验的对象。

2.2 流式细胞仪检测LPS诱导下细胞凋亡

使用流式细胞技术检测1% DMSO 和0.01% TTO 对细胞的作用，图1显示与对照组相比较，1%的DMSO和0.01%的TTO 对细胞并没有伤害。另一方面，由图2可知，A组在没有添加LPS攻毒作用下，仅出现了5%左右早期凋亡和晚期凋亡，B组在添加了100 μg·mL-1LPS攻毒作用下，整体图像发生右移，出现了约8%的早期凋亡和晚期凋亡，但是凋亡效果还不是特别明显，C组在添加了200μg·mL-1LPS，整体图像已出现明显分群，约有50%左右的细胞出现了早期凋亡和晚期凋亡，适宜作为后续试验的乳腺炎模型。

表2 不同浓度LPS诱导细胞增殖活性

A：空白组；B：1% DMSO组；C：0.01% TTO组 A: Blank group; B: DMSO group; C: 0.01% TTO group

图2 LPS诱导细胞凋亡结果

2.3 茶树油对乳腺炎模型的凋亡率的影响

由图3可知，A组空白对照表示没有经过任何处理的正常生长的乳腺上皮细胞凋亡的情况，活细胞比例为92.88%，早期凋亡细胞比例3.32%，晚期凋亡比例3.37%。B组经过200μg·mL-1LPS处理的乳腺上皮细胞出现凋亡，活细胞比例为50.66％，早期凋亡细胞比例45.70%，晚期凋亡比例3.42%。C组至L组分别添加不同浓度的TTO后，D、E和F组取得保护效果，其中E组保护效果最为明显，其活细胞比例71.95%，早期凋亡细胞比例22.15%，晚期凋亡比例5.11%，与B组活细胞相比提高了约22%。

2.4 茶树油对乳腺炎模型炎症因子和凋亡因子的影响

TNF-α和IL-6是与炎症反应有关的炎症因子，STAT1与凋亡反应相关的凋亡因子。由图4可知，在加入200 μg·mL-1LPS后，与空白组相比，TNF-α和IL-6都达到了15倍以上的表达量，STAT1的表达量也达到了将近6倍：在分别加入0.0004%、0.0006%和0.0008% TTO后，与LPS组相比，随着加入的TTO浓度的上升，TNF-α和IL-6基本呈现一个表达量下降的趋势，其中TNF-α表达量的下降幅度更加大，IL-6的表达量则表现为差异极显著，STAT1的表达量在加入0.0004%TTO浓度时有轻微的上调，在0.0006%和0.0008%TTO浓度时表达量均低于LPS组，其中0.0006%TTO浓度时表达量最低。

2.5 茶树油对乳腺炎模型炎症蛋白和凋亡蛋白表达量的影响

NF-κB与MAPK均是与炎症相关的蛋白，Caspase-3是与凋亡反应相关的蛋白。试验结果如图5所示，在加入200μg·mL-1LPS后，与空白组相比，LPS组极显著提高了NF-κB、MAPK和Caspase-3的表达量；在加入有效浓度TTO后，与LPS组相比，3组TTO试验组均极显著降低了NF-κB、MAPK和Caspase-3的表达量。

3 讨论

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌（G-）细胞外膜上一种大分子结构成分，细菌死亡溶解或用人工方法破坏细菌细胞后才释放出来。其毒性成分主要为类脂质A，能够引起哺乳动物细胞发生免疫反应，从而导致促炎因子的释放[17]，王林枫等[18]证实LPS可显著影响奶山羊肝脏的营养代谢。用LPS诱导奶牛乳腺炎模型可以很好的复制奶牛乳腺炎发病的整个过程[19]。本试验在构建乳腺炎模型时，在50μg·mL-1LPS刺激下，细胞的增殖活性有了一定的增强，在100 μg·mL-1以上时则表现为活性减弱。这个结果与前人研究相一致，表明LPS具有双重作用，低浓度LPS的刺激可以提高机体免疫系统的活性，增强原有细胞的增殖活性[20]，而高浓度的LPS则会导致严重的炎症反应，进而致使细胞凋亡[21]。

图3 不同浓度TTO对乳腺炎模型凋亡率的影响

与空白对照组比较，#表示差异显著( P＜0.05) ，##表示差异显著( P＜0.05); 与 LPS 组比较，*表示差异显著( P＜0.05)，** 表示差异极显著( P＜0.01)。下同

茶树油对于大肠杆菌细菌及其内毒素具有良好的抑制作用，GUSTAFSON等[22]研究发现茶树油对大肠杆菌指数期和稳定期细胞的自溶有促进作用。王懿等[23]在小鼠上证明茶树油对LPS诱导的炎症具有显著抑制效果。据此猜测，茶树油在奶牛乳腺炎中也会起到积极的作用。本试验中，通过流式细胞仪结果图可直观发现加入适宜浓度的茶树油后，受到LPS侵染后正常存活细胞的比例明显上升，早期凋亡和晚期凋亡以及死细胞的比例下降。细胞对感染作出的免疫反应主要表现为细胞因子大量释放[24]，LPS诱发乳腺急性炎症时，细胞会产生TNF-α和IL-6等促炎细胞因子[25]，也会产生STAT1等促凋亡因子[26]。TNF-α是感染初期的主要细胞因子，与大肠杆菌型乳腺炎内毒素休克有着密不可分的关系[27]，并且对中性粒细胞具有趋化作用。IL-6是一个多效性的细胞因子，能够介导许多免疫反应及炎症反应[28]。本试验表明，加入适宜浓度茶树油可以明显抑制LPS诱导的炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达，其中对TNF-α的抑制效果更好。STAT1能够促凋亡、抑制细胞生长、分化，在抑制肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[29]。可以发现，适宜浓度茶树油能够一定程度抑制STAT1的表达。

前人研究发现，炎性细胞因子主要是通过NF- κB[30]与MAPK[31]信号通路活化产生，而促凋亡因子主要通过Caspase-3[32]通路活化产生。为了进一步探究茶树油素抑制炎性细胞因子产生与促凋亡因子产生的机制，本试验检测了茶树油对NF-κB、MAPK和Caspase-3这3个蛋白表达量的情况。根据双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）发现，受到LPS侵染的乳腺上皮细胞的NF-κB、MAPK和Caspase-3表达量较高，在添加适宜浓度的茶树油后，NF-κB、MAPK和Caspase-3的表达量均显著下降。以上结果可以表明，适宜浓度茶树油可以在炎症反应发生时抑制NF-κB、MAPK和Caspase-3的产生，阻止、和过量表达，从而对LPS诱导的奶牛乳腺炎起到保护作用。故此推测茶树油在机体内可以抑制NF-κB、MAPK和Caspase-3信号通路的活化，从而对奶牛乳腺炎起到保护作用。

4 结论

茶树油能够在LPS诱导的奶牛乳腺炎模型中抑制炎症因子、凋亡因子以及相应信号通路蛋白的表达，降低细胞凋亡率，对LPS诱导的奶牛乳腺炎的具有一定的作用。本试验中0.0004%—0.0008%茶树油效果最佳。

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Effect and Mechanism of Tea Tree Oil on LPS Induced Mastitis in Dairy Cows

CHEN Zhi, ZHANG Yi, LU QinYue, GUO JiaHe, LIANG Yan, ZHANG MingYiXing, YANG ZhangPing

College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu

【】Cow mastitis has been one of the biggest challenges in dairy farming and dairy products industry, which restricts the healthy development of dairy industry. Effective prevention and treatment of cow mastitis can provide a good guarantee for the health of cows and the production of high-quality dairy products. This experiment explored the effects of tea tree oil on LPS-induced mastitis in dairy cows, and explored the feasibility of using tea tree oil instead of antibiotics to treat mastitis in dairy cows. This experiment provides a reference for the treatment of dairy cow mastitis with tea tree oil. 【】The cells in good condition, were selected, which were added 50, 100, 200, 500, and 1 000 μg·mL-1LPS respectively in the culture of these cells to detect the relevant indicators. The tea tree oil and LPS were added to the model for co-culture. The model of dairy cow mastitis induced LPS was established by the CCK-8 method, flow cytometry, real-time fluorescence quantification and ELISA assay. Antagonistic effect of tea tree oil on LPS in dairy cow mastitis cell model: 0.0002%, 0.0004%, 0.0006%, 0.0008%, 0.001%, 0.002%, 0.004%, 0.006%, 0.008% and 0.01% tea tree oil were added to the dairy cow mastitis cell model induced by 200 μg·mL-1LPS for 12 hours to detect the related indexes. 【】CCK-8 method was used to detect the cell proliferation activity. The results showed that under the condition of 100 μg·mL-1LPS poisoning, the activity of the cells began to decline in varying degrees. There was not a large number of apoptosis in 100 μg·mL-1LPS after 12 hours of induction, while about 46% of the cells showed early and late apoptosis in 200 μg·mL-1LPS. 200 μg·mL-1LPS induced for 12 hours was the best condition for the establishment of mastitis model. The results also showed that when tea tree oil concentration was 0.0004%, 0.0006% and 0.0008%, the apoptosis rate of the cells decreased. Among them, when tea tree oil concentration was 0.0006%, the protection effect was the most obvious. The proportion of living cells was 71.95%, the proportion of early apoptotic cells was 22.15%, and the proportion of late apoptotic cells was 5.11%; compared with the living cells, the proportion of the mastitis model group of tree oil increased by about 22%. After that, the expression of cytokines and apoptotic factors were detected by qPCR in the three groups with protective effect. With the increase of the concentration of tea tree oil, the expression of TNF-α was down regulated more, the expression of IL-6 was down regulated less (< 0.01), and the expression of STAT1 was up regulated slightly when 0.0004% tea tree oil was added, while down regulated slightly when 0.0006% and 0.0008% tea tree oil were added, and the expression of tea tree oil with 0.0006% concentration was the lowest (< 0.05). The expression of NF-κB, MAPK and caspase-3 was significantly reduced in the three groups of tea tree oil adding concentration. Among them, the expression of inflammatory response protein in 0.0006% tea tree oil group was the lowest, about 50% of that in the blank control group. The protein expression was almost the same, about 55% of the blank control group (< 0.05).【】Tea tree oil had a certain antagonistic effect on LPS within the appropriate concentration range, which could reduce the proportion of apoptosis, improve the survival proportion of normal cells, and down regulate the expression of inflammatory factors, apoptosis factors and corresponding proteins.

tea tree oil; cow; LPS; mastitis; effect mechanism