氯喹对脂多糖诱导的Ⅱ型肺泡细胞损伤的影响

朱莹莹，张姣姣，孙俊楠，王海嵘

（上海交通大学医学院附属新华医院急诊医学科，上海 200092）

脓毒症是宿主对感染的反应紊乱所致威胁生命的器官功能障碍[1]。急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是脓毒症中常见的器官功能障碍。研究表明，肺泡损伤是ARDS的主要机制之一[2-3]。尸检发现，临床诊断为中重度ARDS的患者中有40%～58%存在弥漫性肺泡损伤[4]。哺乳动物的肺泡上皮分为Ⅰ型和Ⅱ型2种，其中Ⅱ型肺泡（alveolar typeⅡ，AT2）细胞占大多数，AT2细胞呈立方形，可以合成并分泌肺泡表面活性物质，调节肺泡表面张力，保证在呼吸过程中肺泡的适当充盈和收缩。此外，AT2细胞还具有干细胞特性，可以增殖并转化为AT1细胞[5-6]，有助于修复肺泡上皮。

氯喹（chloroquine，CQ）是一种4-氨基喹啉药物，不仅广泛用于预防和治疗疟疾，还可用于治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病以及癌症[7-8]。有研究发现CQ可减轻H5N1病毒感染和出血性坏死性胰腺炎导致的ARDS[9-10]，但CQ对脓毒症中ARDS的影响尚不明确。

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/Akt信号通路是细胞内至关重要的信号转导途径之一。PI3K/Akt信号通路对细胞增殖、细胞凋亡、血管形成等多种细胞活动均有调节作用，进而影响癌症[11]、多发性骨髓瘤[12]等多种疾病。

本课题组前期研究发现，CQ可以通过激活PI3K/Akt信号通路以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡[13-14]，但CQ对脓毒症所致的AT2细胞损伤是否也有保护作用尚不明确。本研究旨在探究CQ是否能缓解LPS诱导的AT2细胞损伤，以及PI3K/Akt信号通路在其中的作用。

材料与方法

一、主要材料

AT2细胞株为实验室保存，购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。磷酸CQ购自美国Cell Signaling Technology公司，LPS来源大肠杆菌（Escherichia coli）血清型O55：B5购自美国Sigma-Aldrich公司；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）为上海翊圣生物科技有限公司产品；一抗为β-肌动蛋白（β-actin）（美国abcam）、β-微管蛋白（β-tubulin）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、Bcl-2、Bax、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗小鼠抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）、HRP标记山羊抗兔抗体（上海莱兹生物科技有限公司）、裂解的胱天蛋白酶3（美国Cell Signaling Technology公司）；PI3K抑 制剂LY294002购自 上海碧云天生物技术有限公司。

二、方法

1.药物浓度筛选：取对数生长期的AT2细胞配制成1×104/mL的细胞悬液，以每孔100μL均匀铺于96孔板。分别向各孔加入1、10和50 mg/L的LPS处 理AT2细 胞24 h或0.5、5、10、25、50、100μmol/L CQ处理AT2细胞4 h。弃去96孔板原有培养基，每孔加入100μL新鲜配制含10%CCK-8试剂的完全培养基，放回培养箱。2 h后取出，用酶标仪检测各孔450 nm波长的A值，并计算细胞活力。细胞活力=（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）。

2.细胞分组：取处于对数生长期的AT2细胞进行实验，用含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液和89%DMEM高糖培养基的完全培养基培养AT2细胞。将细胞分为正常对照组（完全培养基）、LPS处理组（单加LPS）、CQ处理组（单加CQ）和LPS+CQ组（加入LPS和CQ共处理）4组；后增加LPS+CQ+LY294002组（加 入LPS、CQ和LY294002共处理）。

3.CCK-8法检测细胞活力：取对数生长期的AT2细胞铺在96孔板中，每孔10 000个细胞，用100μL完全培养基培养。待细胞贴壁后，按上述实验分组分别加入药物作用24 h。吸出孔中原有培养基，加入新鲜含10% CCK-8试剂的完全培养基，每孔100μL。在CO2恒温培养箱中培养2 h后取出，用酶标仪检测450 nm波长的A值，并计算细胞活力，计算方法同上。

4.蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达：将AT2细胞均匀接种在6孔板中，当孔中细胞融合至约70%时，更换为不含血清的DMEM高糖培养基培养12 h，后按上述分组处理细胞。24 h后弃去原有培养基，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2次，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀实验（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液于冰上反应30 min，13 523×g，4℃离心15 min，收集上清，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测浓度后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转膜及快速封闭液室温下封闭15 min后，加入β-微管蛋白、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3、裂解的胱天蛋白酶3、Akt、p-Akt抗体于4℃孵育过夜，用TBST洗涤10 min×3次，加入对应二抗室温下孵育1 h，用TBST洗涤10 min×3次后进行曝光显影。

三、统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，用Graphpad Prism 6.0进行绘制。用±s表示计量资料。采用t检验和单因素方差分析比较组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、药物对AT2细胞活力的影响

用LPS处理AT2细胞24 h后，CCK-8检测细胞活性显示，与对照组（100.00%±1.80%）相比，LPS为1 mg/L（97.03%±4.73%）、10 mg/L（97.12%±3.32%）时，AT2细胞活力无明显变化（P分别为0.366 8、0.257 9），LPS为50 mg/L（76.84%±1.40%）时，AT2细胞活力降低显著（P=0.000 6）（见图1A）。因此用50 mg/L LPS刺激细胞24 h以构建AT2细胞脓毒症细胞模型。用CQ处理AT2细胞4 h，CCK-8结果显示，与对照组（100.00%±1.07%）相比，CQ 0.5μmol/L和5μmol/L对AT2细胞活力无明显影响（分别为98.11%±1.67%、99.06%±3.19%，P分别为0.104 9、0.596 2）；当CQ终浓度为10μmol/L（87.80%±1.20%），AT2细胞活力下降（P＜0.000 1)（见图1B）。因此选用5μmol/L作为CQ的治疗浓度。

图1 LPS和CQ对AT2细胞活力的影响

二、CQ对LPS诱导所致AT2细胞损伤的影响

CCK-8检测细胞活力发现，与对照组（100.00%±2.58%）相比，LPS（80.89%±2.51%）能明显降低细胞活力（P=0.001 2）；而5μmol/L CQ预处理4 h后用50 mg/L LPS处理24 h（101.6%±2.92%），细胞活力与对照组相比无明显改变，与LPS组相比明显增加（P=0.000 7），而CQ本身（94.33%±3.42%）对细胞活力无明显影响（P=0.265 3）（见图1C）。

三、CQ对AT2细胞线粒体凋亡途径的影响

用蛋白质印迹法检测线粒体凋亡相关蛋白发现，与对照组相比，LPS组裂解的胱天蛋白酶3表达增加（P＜0.05），Bax蛋白水平增加，而Bcl-2表达减少，Bcl-2/Bax比值减少（P＜0.05）；CQ和LPS共同作用后上述蛋白和LPS组呈现相反改变，Bcl-2/Bax蛋白比值增加（P＜0.05），裂解的胱天蛋白酶3表达减少（P＜0.05）；CQ单独作用对裂解的胱天蛋白酶3无明显作用（P＞0.05），Bcl-2/Bax比值较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1、图2A、B）。

四、Akt蛋白在CQ减轻LPS诱导的AT2细胞损伤中的改变

蛋白质印迹法检测Akt蛋白的磷酸化发现，与对照组相比，LPS组中p-Akt水平减弱（P＜0.05）；CQ和LPS共处理组中，与LPS组相比，p-Akt增加（P＜0.05）（见表1、图2C）。

表1 CQ对AT2细胞凋亡相关蛋白及Akt蛋白磷酸化水平的影响（n=3，±s，%）

表1 CQ对AT2细胞凋亡相关蛋白及Akt蛋白磷酸化水平的影响（n=3，±s，%）

1）：与正常对照组相比，P＜0.05；2）：与LPS处理组相比，P＜0.05。

组别 裂解的胱天蛋白酶3 Bcl-2/Bax p-Akt/Akt正常对照组 0.97±0.05 1.01±0.11 0.86±0.05 LPS处理组 1.72±0.181) 0.63±0.061）0.70±0.031）CQ处理组 0.98±0.11 0.85±0.05 0.93±0.11 LPS+CQ组 0.99±0.042) 1.10±0.102）1.08±0.082）

五、PI3K/Akt信号通路在CQ减轻LPS诱导的AT2细胞损伤中的作用

与对照组相比，LPS刺激后裂解的胱天蛋白酶3表达增加（P＜0.05），Bax增多，Bcl-2表达减少，Bcl-2/Bax比值减少（P＜0.05）；CQ和LPS共处理后凋亡相关蛋白和LPS组呈现相反改变，裂解的胱天蛋白酶3减少（P＜0.05），Bcl-2/Bax比值增加（P＜0.05）；而加入PI3K抑制剂LY294002干扰后，裂解的胱天蛋白酶3增加（P＜0.05），Bax增加，Bcl-2减少，Bcl-2/Bax比值减少（P＜0.05）（见图3、表2）。

表2 PI3K/Akt通路在CQ减轻LPS诱导的AT2细胞损伤中的作用（n=3，±s，%）

表2 PI3K/Akt通路在CQ减轻LPS诱导的AT2细胞损伤中的作用（n=3，±s，%）

1）：与正常对照组相比，P＜0.05；2）：与LPS处 理组 相 比，P＜0.05；3）：与LPS+CQ组相比，P＜0.05。

组别 裂解的胱天蛋白酶3 Bcl-2/Bax正常对照组 0.45±0.05 0.97±0.07 LPS处理组 1.13±0.101） 0.73±0.041）LPS+CQ组 0.71±0.042） 1.30±0.052）LPS+CQ+LY294002组 1.09±0.043） 0.98±0.063）

讨 论

脓毒症是重症监护病房患者非冠状动脉疾病死亡的主要原因之一，具有高发病率、高死亡率的特点。在脓毒症中，ARDS是造成脓毒症死亡率居高不下的主要因素之一[15]。肺泡上皮细胞损伤是ARDS的主要机制之一[2-3]。AT2细胞的重要功能之一是合成、储存、分泌肺泡表面活性物质，可以帮助调节肺泡表面张力辅助呼吸[3]。研究发现，AT2细胞还在增强肺泡液清除率和减少肺部炎症方面起积极作用[16]。

CQ是经典的预防和治疗疟疾的药物，文献报道CQ可以抑制AT2细胞凋亡，减轻百草枯导致的小鼠肺损伤[17]。但CQ对脓毒症中AT2细胞损伤的作用尚不明确。本研究构建了LPS诱导所致的AT2细胞损伤模型，并筛选出合适的CQ治疗浓度。进一步用CQ处理LPS诱导的AT2细胞损伤模型，观察CQ对细胞活力和细胞凋亡的作用。结果显示，CQ能够显著逆转LPS诱导所致的细胞活力下降，促进细胞增殖。

Bcl-2家族是细胞线粒体凋亡途径中的关键蛋白，也是Akt信号通路的下游调控因子，且多项研究发现Akt蛋白磷酸化激活可以减轻细胞凋亡[11-12]。本课题组以往在其他细胞模型中研究发现CQ可以激活PI3K/Akt信号通路以抑制LPS诱导的细胞凋亡[13-14]，故我们推测CQ可能通过激活Akt蛋白，从而减轻LPS诱导所致的AT2细胞凋亡。

细胞凋亡是细胞为维持内环境稳定而进行的细胞自主有序死亡，最常见的启动途径是线粒体途径（内源性途径）和外源性途径。我们的前期研究和相关文献均发现CQ可以抑制线粒体凋亡的发生[13,18]。本研究结果显示CQ作用后，Bcl-2/Bax比值增加，裂解的胱天蛋白酶3表达下降，提示对于AT2细胞株，CQ可以通过抑制线粒体凋亡途径，从而减轻LPS诱导造成的AT2细胞凋亡。

图2 CQ对AT2细胞凋亡相关蛋白及p-Akt水平的影响

图3 PI3K/Akt通路在CQ减轻LPS诱导的AT2细胞损伤中的作用

PI3K/Akt信号通路中，Akt可被磷酸化激活，调控下游因子，参与细胞代谢、细胞死亡和细胞迁移等多种重要的细胞过程；线粒体凋亡途径中Bcl-2家族是PI3K/Akt信号通路激活后的下游调控因子。本课题组在LPS诱导的人脐静脉内皮细胞损伤模型研究中发现，CQ可以通过激活PI3K/Akt信号通路，减轻LPS诱导的血管内皮细胞凋亡[14]。因此，本研究对AT2细胞中Akt蛋白活化水平进行研究。Akt蛋白的活化水平可以通过Akt蛋白的磷酸化水平和Akt蛋白活性试剂盒进行检测。本研究通过蛋白质印迹实验检测各组p-Akt水平，结果发现LPS可以减少Akt蛋白的磷酸化水平，而加入CQ后，LPS的作用被逆转，Akt磷酸化增加，说明CQ可以通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡的发生。为了进一步验证CQ主要通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制LPS诱导的AT2细胞凋亡，本研究加入了PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002（LPS+CQ+LY294002组），结果发现，抑制PI3K/Akt信号通路后，Bcl-2/Bax比值降低，且裂解的胱天蛋白酶3水平上升，即CQ对AT2细胞株的抗细胞凋亡作用被消除，表明CQ的确是通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制LPS诱导的AT2细胞凋亡。

综上所述，LPS可以损伤AT2细胞，而CQ能够通过激活PI3K/Akt信号通路，增加Akt蛋白磷酸化，抑制线粒体凋亡，减轻LPS诱导的AT2细胞损伤。FAS/FASL信号通路是细胞凋亡中的主要调控途径之一，下一步本课题组将对该信号通路进一步研究。同时本课题组将着眼细胞功能，探究CQ对AT2细胞合成分泌炎症因子、肺表面活性物质等的影响。