卵泡抑素样蛋白1对氧化低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞增殖的影响

肖 凡，查 晴，刘 亚，杨 玲，叶佳雯，刘 艳

（上海交通大学医学院附属第九人民医院心血管内科，上海 200011）

目前，心血管病的负担越来越严重，已成为全球较为严重的公共卫生问题。流行病学研究显示心血管病的死亡率占居民总死亡原因的首位[1]。而脂质沉积是心血管病的重要危险因素之一[2]。既往研究证明，氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL）诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖效应可被沉默信息调节蛋白1（silencing information regulatory protein 1，SIRT1）阻断[3]。抑制平滑肌细胞的增殖则有利于抵抗血管重构，从而减少血管生理异常的发生和发展[4-5]。

本课题组前期研究发现，APE小鼠发生脂质沉积的血管区域中存在卵泡抑素样蛋白1（follistatinlike protein 1，FSTL1）表达降低的现象。有研究报道，FSTL1也可参与细胞增殖调控的过程中[6]，例如FSTL1抑制增殖相关通路的激活从而抑制肿瘤细胞增殖能力[7]。FSTL1是否参与Ox-LDL调控血管增殖的过程鲜有报道。本研究旨在探讨Ox-LDL和FSTL1参与VSMC增殖发生和发展。

材料与方法

一、材料

4周龄、雄性C57BL/6J小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司）用于VSMC的提取。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、青霉素-链霉素（penicillin-streptomycin）双抗溶液、抗青霉素-链霉素-新霉素（anti-penicillin，streptomycin,and neomycin）三抗溶液、0.25%胰蛋白酶（trypsin）、DMEM培养基（dulbecco’s modified eagle medium）均购自美 国Gibco公司。其他有人重组FSTL1（美国R&D Systems公司）、SIRT抑制剂（中国Med Chem Express公司）、细胞活力检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）（日本Dojindo公司）。RNA反转录试剂盒及实时定量PCR检测试剂盒购于日本Takara公司。FSTL1抗体（1∶1 500）购自美国Abcam公司。Ox-LDL购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

二、方法

1.动物分组：实验动物载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）-/-小鼠分为对照组（普通饲料喂养4个月）和血管病变组（高脂喂养4个月），每组6只小鼠。实验重复3次。实验周期结束后将小鼠处死。保留心脏、血管和肾脏等组织用于后续实验检测。

2.VSMC的提取和鉴定：将小鼠麻醉致死，剥离取小鼠主动脉并浸泡于10%的三抗溶液中。于显微镜下仔细剥离血管外膜的脂肪、胶原和血管等组织，并将其从中剖开，用沾有三抗溶液的棉棒将血管内膜的内皮细胞刮除。随后，将剥离干净的血管组织转移至超净台中，用三抗溶液再次洗涤2～3次，随后用显微剪将其剪成小组织块。最后加入少许FBS，将其与组织块混合均匀放入培养箱45 min～1 h。待FBS将组织块黏于皿底后加入DMEM培养基（DMEM+10%FBS+1倍双抗）。培养至约1周，可见组织块边缘有平滑肌细胞爬出。可加入胰酶将细胞消化下来,重新接种于新的培养皿，用于后续细胞鉴定和实验。

3.细胞增殖实验：取100μL对数期的细胞接种于96孔板中；每组设置6个复孔，实验处理结束后，每个孔中加入10μL的CCK-8溶液，重新放入培养箱培养5 h。酶标仪设定450 nm吸光度A值。根据公式计算：增殖率（细胞活力）=（实验组-空白对照）/（阴性对照-空白对照）×100%，实验组为实验组细胞和CCK-8溶液的A值；阴性对照为对照细胞和CCK-8溶液的A值；空白对照为培养基和CCK-8溶液的A值。实验重复5次。Ox-LDL刺激浓度分别为12.5、25和50 mg/L，Ox-LDL联合FSTL1刺激浓度分别为50 mg/L和100μmol/L。

4.蛋白质印迹（Western blotting）：运用细胞裂解液提取总蛋白，细胞实验条件为Ox-LDL刺激浓度0、12.5、25、50 mg/L，刺激时间0、6、12和24 h；然后用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）法测定蛋白浓度，并计算所需要的蛋白样品体积，总体积20μL（上样缓冲液体积∶蛋白样品体积=1∶3）；将样品置于100℃加热10 min，使样品变性。将样品和标志物加入电泳胶的加样孔内；电泳分离不同分子量的蛋白，120 V电泳，时间为标志物对应的目的条带分离时终止电泳；电泳后切除多余的胶。将胶转移至转膜液中放置15 min，将事前准备的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（0.45μm）泡于甲醇中10 min，制作转膜“三明治”顺序为：转移盒负极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-转移盒正极的顺序由下而上放置（300 mA）；转膜结束后封闭（5%牛奶、1 h）；洗膜缓冲液（Tris buffered saline Tween，TBST）洗5次，每次5 min；加一抗孵育（1∶1 500、4℃、12 h）；TBST洗5次，每次5 min；加入二抗孵育（室温、1 h），配置显影液，拍照观察。实验重复5次。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参。

5.免疫组织化学（免疫组化）：取新鲜的血管样品经4%甲醛固定，随后用石蜡包埋并切片。用二甲苯对组织切片进行脱蜡。将样品依次浸入无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇各5 min，最后用双蒸水清洗。用拘橼酸盐修复液修复抗原表位（pH 6.0、95℃2 min），自然冷却样品至室温，TBS溶液洗涤样品3次，每次5 min。用3%双氧水阻断内源性过氧化物酶的作用20 min，TBS溶液洗涤样品3次，每次5 min。用5%马血清封闭、室温、30 min，加一抗1∶1 5 00，4℃孵育12 h。将样品从冰箱取出，室温放置30 min；TBS溶液洗涤样品3次，每次5 min；加入二抗1∶5 000室温孵育30 min。TBS溶液洗涤样品，PBS孵育10 min，TBS溶液洗涤样品3次，每次5 min。配置二氨基联苯胺显色溶液，控干TBS后，将二氨基联苯胺显色溶液加于组织上。于显微镜下观察到黄色阳性染色出现后，吸掉染色液，将样品置于蒸馏水中终止反应。苏木素复染细胞核3 min，自来水洗掉染色液，盐酸乙醇分化5～10 s，自来水冲洗；分化后将样品依次浸入95%乙醇1～3 min，无水乙醇5 min；中性树脂封片；显微镜观察。免疫组化采用半定量分析方法，采用image pro plus软件分析积分光密度（integrated optical density，IOD值），最后用IOD值/面积。实验重复6次。

6.免疫荧光：实验刺激结束后用PBS洗细胞3次，加入4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS洗涤样品3次。5%马血清封闭，室温、1 h。加一抗1∶500，4℃孵育12 h；PBS洗涤样品3次；加二抗1∶1 000室温、1 h，PBS洗涤样品3次。4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色15 min，PBS洗涤样品3次。采用40倍镜观察，每个细胞皿取上、下、左、右、中5个视野，每个视野的细胞数为3～5个。重复5次。

三、统计学分析

结 果

一、原代VSMC的鉴定

免疫荧光检测原代平滑肌细胞中特异性蛋白α-SMA的表达，结果显示，提取的细胞具有α-SMA的表达，且细胞形态为长梭型，证明提取的细胞为小鼠原代VSMC（见图1）。

二、Ox-LDL下调FSTL1表达量

免疫组化染色分析结果显示，与小鼠正常血管组织相比，FSTL1在Ox-LDL沉积的病变血管组织中表达减少（0.223±0.010比0.097±0.019，t=27.381，P＜0.01）（见图2）。

图1 原代细胞免疫荧光染色（40×）

图2 FSTL1在Ox-LDL沉积的病变组织中表达情况

Ox-LDL 0、12.5、25、50 mg/L分别刺激VSMC 24 h，蛋白质印迹法检测FSTL1表达水平分别为1.330±0.055、0.905±0.027、0.753±0.037和0.243±0.016，在Ox-LDL浓度最高时，FSTL1表达水平最低（F=260.600，P＜0.000 1）（见图3A）。

50 mg/L Ox-LDL分别刺激VSMC 0、6、12、24 h，蛋白质印迹法检测FSTL1的表达分别为1.383±0.033、0.782±0.047、0.381±0.022和0.230±0.017，Ox-LDL诱导时间为24 h时，FSTL1表达水平最低（F=151.000，P＜0.000 1）（见图3B）。

图3 VSMC的FSTL1表达量

三、FSTL1抑制Ox-LDL诱导的平滑肌细胞增殖

CCK-8检测结果显示，与对照组相比，Ox-LDL组VSMC增殖能力增加（0.870±0.010比1.890±0.020，t=7.852，P＜0.01）。但Ox-LDL+FSTL1共刺激后，VSMC增殖能力比Ox-LDL组低（1.890±0.020比1.200±0.023，t=11.85，P＜0.01）（见表1）。

四、FSTL1抵抗Ox-LDL诱 导VSMC的 表 型转化

蛋白质印迹实验结果显示，在Ox-LDL刺激下VSMC的OPN表达上升（t=14.700，P＜0.01），但α-SMA（t=15.341，P＜0.01）和SIRT1表达减少（t=12.180，P＜0.01）（见图4）。

而FSTL1与Ox-LDL共刺激的条件下，VSMC出现OPN表达减少（t=27.790，P＜0.05），但α-SMA（t=11.151，P＜0.05）和SIRT1表达增加（t=17.800，P＜0.01）（见图4）。

五、FSTL1通 过SIRT1抑 制Ox-LDL诱 导VSMC的表型转化

与Ox-LDL+FSTL1组相比，Ox-LDL+FSTL1+SIRT1抑制剂组VSMC中α-SMA和SIRT1表达减少，但OPN表达增多（均P＜0.01）（见表2、图5）。

图4 FSTL1对抗Ox-LDL刺激导致的VSMC表型转化

使用蛋白质印迹法检测VSMC在对照组、Ox-LDL刺激组和Ox-LDL+FSTL1组3种情况中SIRT1、α-SMA和OPN的表达量。

图5 FSTL1通过SIRT1抑制Ox-LDL诱导的VSMC表型转化

六、FSTL1通 过SIRT1抑 制Ox-LDL诱 导VSMC的增殖

使用CCK-8检测方法评估VSMC在不同条件下的增殖能力显示，与Ox-LDL+FSTL1组相比，Ox-LDL+FSTL1+SIRT1抑制剂组VSMC增殖能力增加（t=7.271，P＜0.01）（见表2）。

表1 VSMC的增殖检测和蛋白表达量(均n=5，±s)

表1 VSMC的增殖检测和蛋白表达量(均n=5，±s)

1)：与对照组相比，P＜0.01；2)：与Ox-LDL刺激组相比，P＜0.01。

项目 对照组 Ox-LDL刺激组 Ox-LDL+FSTL1组 F P A450 nm0.870±0.010 1.890±0.0201) 1.200±0.0232) 314.800 ＜0.000 1 OPN 1.001±0.031 2.698±0.0011)1.590±0.0012)236.200 ＜0.000 1 α-SMA 1.303±0.030 0.493±0.0691) 0.653±0.0152) 407.700＜0.000 1 SIRT1 0.993±0.044 0.613±0.0301) 1.231±0.0112) 383.500 ＜0.000 1

表2 VSMC的增殖检测和蛋白表达量(均n=5，±s)

表2 VSMC的增殖检测和蛋白表达量(均n=5，±s)

项目 Ox-LDL+FSTL1组 Ox-LDL+FSTL1抑制剂组 t P OPN 1.643±0.047 3.533±0.100 17.256 ＜0.01 α-SMA 0.530±0.033 0.283±0.032 6.696 ＜0.01 SIRT1 1.056±0.020 0.207±0.021 28.821 ＜0.01 A450 nm 1.280±0.033 2.030±0.092 7.271 ＜0.01

讨 论

大中动脉的血管壁主要由三层结构组成，内皮细胞构成内膜，平滑肌细胞参与中膜的形成，外膜则由疏松结缔组织组成。血管中膜在构成血管张力上起重要作用，但血管中膜平滑肌细胞的异常增殖是导致高血压、动脉粥样硬化等血管性疾病发生、发展的关键始动因素之一[8]。导致VSMC增殖的原因有很多。研究报道，Ox-LDL是导致血管病变的重要因素之一[9-10]。Ox-LDL沉积的病变血管区域存在较多血管生理异常的现象[11]。Ox-LDL可诱导VSMC由收缩表型（蛋白标志物α-SMA）向分泌表型（蛋白标志物OPN）转化，从而导致VSMC增殖能力增加[12]。这种现象在本研究过程中也有发现，Ox-LDL的刺激可导致VSMC的表型转化，进而导致其增殖能力增加。此外，Ox-LDL可以导致机体中保护性因子的减少，从而诱发疾病的发生、发展[13]。本研究也发现，FSTL1这一心血管保护性因子，随着Ox-LDL诱导的浓度和时间增加，平滑肌细胞表达的FSTL1呈现下降趋势。

既往的研究证明，FSTL1作为外分泌的糖蛋白和许多疾病的发生和发展有关，这可能与参与炎症反应、肿瘤细胞侵袭和迁移、突触传递、血管新生、细胞增殖和凋亡有关[14]。本课题组前期研究发现，Ox-LDL可下调VSMC中FSTL1的含量，且实验结果证实，加入FSTL1后发现，FSTL1能减少Ox-LDL刺激导致的VSMC增殖。这提示，Ox-LDL可能通过下调FSTL1起到诱导VSMC增殖的作用。

文献报道，FSTL1在心血管病中发挥保护心血管的作用。心肌梗死后，FSTL1分泌增多，FSTL1通过DIP2A（disco interacting protein 2 homolog A）受体活化Akt激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路，从而抑制心肌纤维化改善心功能[16]。受到此研究的启发，加之本研究过程也发现Ox-LDL对FSTL1的抑制作用。为揭示VSMC增殖的原因，本研究观测VSMC不同表型对应的标志物。实验证明，Ox-LDL诱导下VSMC由原来的收缩型向分泌型转化，而这种表型转化导致平滑肌细胞增殖能力的增加。而FSTL1能通过激活SIRT1抵抗Ox-LDL诱导的平滑肌表型转化，从而降低Ox-LDL刺激下VSMC的增殖能力。本研究通过探讨FSTL1对于Ox-LDL诱导的VSMC增殖这一病理过程的作用，进一步了解两者的生物学效应。

综上所述，本研究发现Ox-LDL异常沉积的病变血管区存在FSTL1表达下调的现象。加入FSTL1后，发现FSTL1能有效抵抗Ox-LDL对VSMC的增殖作用，这为揭示FSTL1对抗Ox-LDL的血管毒性作用添加了新的证据。