基于叶绿素荧光参数的不同矾根品种耐热性评价

孙 翊，李思源，2，张永春，殷丽青，李青竹，赵会会，3

（1.上海市农业科学院 a.林木果树研究所；b.上海市设施园艺技术重点实验室，上海 201403；2.北京林业大学 水土保持学院，北京 100083；3.安顺学院，贵州 安顺 561000）

矾根Heucheraspp.为虎耳草科Saxifragaceae矾根属Heuchera植物的统称，原产于北美洲，是四季均可观赏的彩叶宿根地被植物[1]。它已经在欧美园林中广泛应用，拥有“花园调色板”的美誉[2-3]。近年来，被引入我国的矾根品种数量逐年增加，累计约100 个。由于其具有品种繁多，叶色丰富，观赏期长，适生性较强等突出优点，在花境、花坛、家庭园艺和立体绿化中得到多种形式的应用，深受市场喜爱，发展前景广阔[4-5]。矾根性耐寒，根据美国农业部植被抗寒性区域划分标准，矾根分布于4～9 区，在我国大部分地区能够顺利露地越冬。然而，在我国多地的矾根引种栽培和园林应用中发现，越夏过程中植株生长困难甚至发生死亡是限制部分矾根品种栽培和推广的关键问题[1,6]。

近年来，随着全球气温的不断上升，植物生长和发育面临更加严峻的挑战。在高温胁迫下，许多观赏植物的表型以及细胞膜系统、蒸腾作用、光合作用等生理特性均会受到不同程度的影响[7]。其中，叶绿素荧光参数能够较直接的反应植物的光化学活性，且操作简单，速度较快，被广泛地应用于观赏植物响应高温胁迫的研究[8-10]。叶绿素荧光参数中的Fv/Fm属于热敏指标，被认为是评价植物耐热性的重要指标[11-13]。

目前，对矾根耐热性评价方面的研究尚不深入，仅限于对少数品种在高温下的光合特性方面开展了一定研究[1,14]。因此，本研究拟通过对不同矾根品种进行热胁迫处理，记录处理后植株状态并根据公式计算热害指数；利用连续激发式荧光仪测定和分析其叶绿素荧光参数，从表型和生理水平进行不同矾根品种耐热性的综合评价，从而建立起一种能够快速进行矾根品种耐热性评价的方法。本研究能够为矾根耐热机理的深入研究奠定良好基础，同时也能够为夏季适生性强的矾根品种的推广和新品种选育工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究供试种质资源来自上海市农业科学院矾根种质资源圃，37 个矾根品种名称及来源见表1。以1年生盆栽植株作为试验材料用于后续试验处理，每个品种处理30 个单株。

表1 37 个矾根品种名称及其来源Table 1 37 varieties of Heuchera spp.and their sources

续表1Continuation of table 1

1.2 试验方法

试验于2019年4月至2019年5月期间在上海农业科学院奉浦院区进行。将试验材料移入人工气候箱（上海皓庄仪器有限公司，型号HZLED-1000C）内25℃预培养3 h，之后进行45℃高温胁迫处理，处理时间为6 h。试验过程中空气相对湿度为（50%±5%），光照强度为22 000 lx。高温胁迫处理结束后将供试植株放入资源圃中进行恢复栽培。

1.2.1 耐热级别统计和热害指数计算

在试验过程中拍照记录处理0、3 和6 h 后的植株状态，并根据叶片灼伤、卷曲等情况计算比例，每个品种随机抽取20 个单株进行耐热级别统计。耐热级别共分为5 级：0 级，植株正常生长；1 级，少于25%的叶片表现卷曲；2 级，25%～50%的叶片表现卷曲，叶缘有灼伤；3 级，50%～75%的叶片表现卷曲，叶片灼伤；4 级，75%以上的叶片表现为卷曲或萎蔫；5 级：植株枯死。通过公式计算热害指数[15]。热害指数（%）=Σ（级别株数×级别数）/最高级数×处理总株数×100[16]。

1.2.2 叶绿素荧光参数的测定

参考吴久赟等[13]的方法，利用连续激发式荧光仪（Pocket Plant Efficiency Analyzer，英国Hansatech公司）测定矾根叶片叶绿素荧光动力学参数。为便于测定操作，每次只选取1 个品种置于人工气候箱内进行高温胁迫处理。于高温胁迫处理0、3和6 h 后，分别对不同植株的中轮成熟叶片进行叶绿素荧光动力学参数测定。测定或计算FO（初始荧光）、Fm（最大荧光）、Fv/Fm（PS Ⅱ最大光化学效率）、Fv/FO（PS Ⅱ潜在活性）、dVG/dtO（K点的相对可变荧光）、dV/dtO（荧光诱导曲线的初始斜率）、ABS/RC（单位反应中心吸收的光能）、DIO/RC（单位反应中心耗散的能量）、TRO/RC（单位反应中心捕获的用于还原QA 的能量）、ETO/RC（单位反应中心捕获的用于电子传递的能量）、ΦEO（单位反应中心激活PS II 反应中心的能量）、ψEO（反应中心捕获的激子中用来推动电子传递时到电子传递链中超过QA 的其他电子受体的激子占用来推动QA 还原激子的比率）、DIO/CSO（单位受光面积耗散的能量）、PIABS（以吸收光能为基础的性能指数）、RCQA（单位反应中心激活PS II 反应中心的能量）[17]。测定前进行20 min 暗适应处理，荧光以3 500 μmol·m-2·s-1的饱和光诱导，每个品种测定6 个单株，重复3 次。

1.2.3 数据处理与分析

将试验所测得的数据用Excel 2016 软件进行数据录入，并计算平均值与标准偏差。采用SPSS 17.0 软件的方差分析（ANOVA）和多重比较分析（Duncan’s）对测得的数据进行差异显著性分析，显著水平为0.05（P＜0.05）；采用SPSS 17.0 软件的双变量进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫处理对不同矾根品种热害指数的影响

不同矾根品种进行45℃高温胁迫处理后，根据植株状态统计其耐热指数。结果显示（表2），高温胁迫处理3 h 后，供试的所有矾根品种的叶片均未表现出任何灼伤、卷曲的状况，热害指数均为0%。而在处理6 h 后，不同矾根品种之间的热害指数出现明显差异。在37 个矾根品种中，有13个品种的植株叶片并未有任何灼伤、卷曲的状况，热害指数为0%，即未表现出受到热害，说明这些品种的耐热性较强。其余24 个品种的植株叶片表现为不同程度灼伤或卷曲，说明它们的耐热性相对较弱。其中热害指数最大的品种是‘火警’，为40%。根据试验结果可知，在表型水平，不同矾根品种之间的耐热性需经过6 h 45℃高温胁迫处理后能够出现明显差异。根据热害指数测定结果可将矾根品种分为2 类，即耐热性较强的矾根品种（热害指数为0%）以及耐热性较差的矾根品种（热害指数大于0%）。

表2 45℃高温胁迫处理后不同矾根品种的热害指数及其Fv/Fm 值的高温响应表现†Table 2 Heat injury index and Fv/Fm values after 45 ℃ heat stress treatment of Heuchera spp.

2.2 高温胁迫后矾根叶绿素荧光动力学参数指标之间的相关性

对经过3 和6 h 高温胁迫的矾根叶片采用连续激发式荧光仪测定其叶绿素荧光动力学参数，对15 个参数指标分别进行相关性分析，结果见表3～4。在叶绿素荧光动力学参数中，Fv/Fm是植物耐高温胁迫的一个主要参数。本研究结果显示，37 个矾根品种受到高温胁迫后，其叶片的Fv/Fm值均明显下降。由表2可知，3 h 高温胁迫处理后，Fv/Fm与其余14 个指标相关性均为极显著关系；其 中Fv/Fm与Fm、Fv/FO、ETO/RC、ΦEO、ψEO、PIABS、RCQA呈极显著正相关，与FO、dVG/dtO、dV/dtO、ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC、DIO/CSO呈极显著负相关。6 h 高温胁迫处理后（表4），Fv/Fm与TRO/RC 呈正相关关系，但相关性不显著。除TRO/RC 外，Fv/Fm与其余13 个指标相关性情况与3 h 高温胁迫处理后一致。说明高温胁迫会使得绝大部分矾根叶绿素荧光动力学参数发生明显的规律性变化。高温胁迫后，矾根反应中心的初始关闭速率变慢（dVG/dtO,dV/dtO上升），除了单位反应中心捕获的光能（TRO/RC）发生先增加（3 h）后逐渐开始降低（6 h）的过程之外，单位反应中心光能的吸收增加（ABS/RC 上升）后，捕获光能用于电子传递的效率降低（ETO/RC 下降），热耗散增大（DIO/RC 上升），类囊体膜结构发生改变（FO上升），PS Ⅱ最大光化学效率降低（Fv/Fm下降），反应中心对光能的转换效率（ψEO）及电子传递效率（ΦEO）降低。说明高温胁迫会影响矾根叶绿体对光能的吸收效率、反应中心对光能的转换效率和电子传递效率。因此，认为Fv/Fm值可作为矾根叶绿素荧光动力学参数的代表性指标，用于不同矾根品种的耐热性评价。

RCQA 1 PIABS 1 0.795**of Heuchera spp.DIO/CSO ψEO ΦEO†性ETO/RC关相的标指TRO/RC数参光荧素DIO/RC绿叶3 h 后理ABS/RC处迫胁温高dV/dtO 3 45℃表Table 3Correlationanalysis of different chlorophyllfluorescencekinetics parameters after3hhigh temperaturestress at 45℃dVG/dtO Fv/FO Fv/Fm Fm FO 1 Index 标FO指1 0.490**Fm 1 0.538**-0.414**Fv/Fm 1 0.938**0.528**-0.423**Fv/FO 1-0.622**-0.699**-0.426**0.221**dVG/dtO 1 0.953**-0.533**-0.615**-0.469**0.102**dV/dtO 1 0.719**0.801**-0.690**-0.849**-0.403**0.365**ABS/RC 1 0.989**0.654**0.733**-0.702**-0.869**-0.410**0.373**DI0/RC 1 0.419**0.546**0.723**0.783**-0.263**-0.293**-0.154**0.133**TRO/RC 1-0.002-0.510**-0.471**-0.692**-0.562**0.497**0.585**0.518**-0.008 ETO/RC 1 0.935**-0.339**-0.605**-0.612**-0.890**-0.774**0.547**0.635**0.543**-0.039 ΦEO 1 0.944**0.872**-0.359**-0.690**-0.694**-0.861**-0.803**0.771**0.811**0.621**-0.165**ψEO 1-0.582**-0.427**-0.378**0.259**0.776**0.757**0.448**0.548**-0.751**-0.822**-0.063 0.816**DIO/CSO-0.548**0.894**0.749**0.645**-0.374**-0.550**-0.567**-0.715**-0.689**0.843**0.756**0.587**-0.221**PIABS-0.399**0.790**0.660**0.566**-0.368**-0.618**-0.628**-0.656**-0.649**0.761**0.763**。0.915**关相著显）侧双0.140**（平0.01 水在示RCQA† **表**indicatesextremelysignificantcorrelationat 0.01 level.

RCQA 1 PIABS 1 0.807**of Heuchera spp.†性关相的标指数参光荧素绿叶6 h 后理处迫胁温高4 45℃表Table 4Correlationanalysis of different chlorophyllfluorescencekinetics parameters after6hhigh temperaturestress at 45℃DIO/CSO ψEO ΦEO ETO/RC TRO/RC DIO/RC ABS/RC dV/dtO dVG/dtO Fv/FO Fv/Fm Fm FO 1 Index 标FO指1 0.444**Fm 1 0.611**-0.368**Fv/Fm 1 0.923**0.606**-0.390**Fv/FO 1-0.467**-0.475**-0.355**0.141**dVG/dtO 1 0.908**-0.400**-0.450**-0.417**00.015 dV/dtO 1 0.327**0.144**-0.497**-0.680**-0.344**0.244**ABS/RC 1 0.998**0.280**0.096*-0.495**-0.679**-0.342**0.244**DI0/RC 1-0.084*-0.018 0.693**0.713**-0.009 0.025-0.017-0.011 TRO/RC 1-0.065-0.462**-0.468**-0.764**-0.619**0.546**0.645**0.561**-0.031 ETO/RC 1 0.963**-0.310**-0.428**-0.450**-0.896**-0.750**0.516**0.608**0.544**-0.019 ΦEO 1 0.932**0.920**-0.202**-0.503**-0.518**-0.795**-0.694**0.761**0.798**0.661**-0.140**ψEO 1-0.598**-0.429**-0.460**-0.03 0.615**0.615**0.313**0.376**-0.760**-0.837**-0.170**0.776**DIO/CSO-0.540**0.884**0.715**0.692**-0.193**-0.355**-0.369**-0.625**-0.578**0.830**0.719**0.643**-0.185**PIABS-0.465**0.806**0.647**0.630**-0.162**-0.464**-0.476**-0.560**-0.527**0.799**0.795**0.930**0.121**RCQA。关相著显）侧双（平0.01 水在示† **表**indicatesextremelysignificantcorrelationat 0.01 level.

2.3 不同矾根品种叶绿素荧光动力学参数Fv/Fm值对高温胁迫的响应

通过对45℃高温胁迫处理0、3 和6 h 后叶片叶绿素荧光动力学参数Fv/Fm值的测定，研究不同矾根品种对高温胁迫的响应情况。结果显示（表2），在高温胁迫初始阶段（处理0 h 时），供试的所有矾根品种的叶片Fv/Fm值均大于0.8，说明此时的叶绿体未受到胁迫影响，能够正常行使功能。而经过3 和6 h 的45℃高温胁迫处理后，供试的37 个矾根品种的叶片Fv/Fm值均出现明显下降，且绝大部分品种的Fv/Fm值随着高温胁迫时间的增加而降低。说明高温胁迫能够导致叶绿体功能的下降，且受到胁迫的时间越长，其功能下降越明显。经3 h热胁迫处理的植株，尽管在表型上无显著差别，表现为所有品种的3 h 处理后热害指数均为0%，但是其Fv/Fm值已经发生了明显降低，说明矾根叶绿体会迅速响应高温胁迫。此时，耐热性较强的品种和较弱的品种已经发生一定程度的区分，表现为Fv/Fm值下降的程度不同。如耐热性较强的品种‘甜茶’，其Fv/Fm值可以维持在0.761 3，而耐热性较弱的品种‘柠檬黄’，其Fv/Fm值迅速下降至0.342 9。6 h 处理后热害指数仍为0%的品种，如‘秋枫’‘黄金斑马’‘花毯’等，其Fv/Fm值在3 和6 h 之间差异不明显；6 h 处理后热害指数较高的品种，如‘火警’‘柠檬黄’‘蛋挞’等，其Fv/Fm值在3 和6 h 之间差异也不明显；而6 h 处理后热害指数居中的品种，如‘上海’‘桃色火焰’等，其Fv/Fm值呈现随着热处理时间的增加而逐渐降低的趋势。根据试验结果可知，在表型上能够呈现受到高温胁迫之前，矾根叶绿体Fv/Fm值可以反应出矾根植株对高温胁迫的迅速响应。耐热性较弱矾根品种的3 h 处理后Fv/Fm值已经呈现出较低水平；而耐热性较强矾根品种的6 h处理后Fv/Fm值仍可以维持在较高水平。根据Fv/Fm值可将矾根品种分为3 种类型，即6 h 处理后Fv/Fm值仍较高的品种，大部分表现为耐热性较强、3 h 处理后Fv/Fm值已较低的品种，大部分表现为耐热性差，以及Fv/Fm值逐渐降低的品种，大部分表现为耐热性中等。

2.4 不同矾根品种耐热性分析与评价

鉴于Fv/Fm值是矾根耐热性评价的重要指标，因此对不同矾根品种45℃高温胁迫处理后Fv/Fm值与热害指数进行相关性分析（表5）。结果显示，6 h 处理后的热害指数与0 h 处理后的Fv/Fm值不相关，而与3 h 以及6 h 处理后的Fv/Fm值极显著负相关，说明未经热胁迫处理的初始Fv/Fm值并不能够反映矾根品种的耐热性情况，而45℃高温胁迫处理3 和6 h 后测定的Fv/Fm值均能够作为矾根品种耐热性评价的重要参数。3 h 以及6 h处理后的Fv/Fm值之间的相关性系数高达0.969，而相关系数比较情况为|-0.893|＞|-0.888|，说明3 h 处理后的Fv/Fm值与6 h 处理后的热害指数的相关性略强于6 h 的。从有效且简便的角度考虑，采用3 h 处理后的Fv/Fm值作为不同矾根品种耐热性分析的有效指标更为适宜。

表5 不同矾根品种45℃高温胁迫处理后Fv/Fm 值与热害指数的相关性†Table 5 Correlation analysis of the heat injury index and Fv/Fm values after high temperature stress at 45℃ of Heuchera spp.

根据热胁迫处理3 h 后矾根品种的Fv/Fm值和6 h 热害指数情况综合分析，将供试的37 个矾根品种分成3 类（表6）。将热胁迫处理3 h 后矾根品种的Fv/Fm值分为≥0.70，（0.55，0.70），≤0.55 三类，分别对应于耐热性较强（第1 类）、耐热性中等（第2 类）和耐热性较弱（第3 类）的品种类型，并以此作为矾根耐热性评价的标准。对6 h 处理后的热害指数进行相应整理，其分布规律为耐热性较强品种的热害指数为0%，耐热性中等的品种为0%～30%，耐热性较弱的品种为大于等于30%。在37 个矾根品种中，耐热性较强、耐热性中等和耐热性较弱的品种分别为12 个、17个和8 个。本研究结果可为矾根抗热品种选育工作提供理论参考。

表6 不同矾根品种耐热性状况分类Table 6 Classification based on heat tolerance of different varieties of Heuchera spp.

3 结论与讨论

越夏困难甚至死亡是限制许多矾根品种栽培和推广的关键问题[1,6]。限制矾根越夏的因素很多，而高温是其中最为重要的环境因子之一，因此开展不同矾根品种的耐热性评价具有重要意义。本研究以37 个矾根品种为试材，通过对不同矾根品种开展热胁迫处理，根据热害指数和叶绿素荧光动力学参数对其耐热性进行综合评价，建立起一种能够快速进行矾根耐热性评价的方法。据此筛选出‘甜茶’‘橘子酱’‘皇家葡萄酒’等耐热性较强的品种12 个，‘桃色火焰’‘莓果’等耐热性中等的品种17 个；‘火警’‘柠檬黄’等耐热性较弱的品种8 个。本研究为矾根耐热机理的深入研究奠定了良好基础，同时也能够为夏季适生性强的矾根品种的推广以及利用抗性亲本开展耐热矾根新品种的选育工作提供重要参考。

作为一种常异色叶植物，叶色是矾根最为重要的观赏性状之一。叶片观赏价值高且夏季适生性强的矾根品种往往更受市场青睐[3]。本研究结果显示，在耐热性较强、耐热性中等和耐热性较弱的类型中，均包含红色系品种和绿色系品种；黄色系品种多为耐热性较弱类型，如‘柠檬黄’和‘栀子黄’；紫色系品种多为耐热性中等类型，如‘李子布丁’和‘上海’。据此认为，矾根品种的耐热性与叶色表型之间无明显的相关性。该结果能够为观赏价值高且夏季适生性强的矾根品种的推广应用以及新品种选育工作提供一定的科学依据。

热害指数是植物耐热性评价最直接的表型参数，可以较直观地反应植株受高温胁迫伤害的程度，其数值越小，则植物耐热性越强[18]。然而，当表型上发生明显变化时，所需的热胁迫时间较长，且植株受害已经较为严重，往往难以恢复。叶绿素荧光动力学参数能够较直接地反应植物的光合能力，对高温胁迫的响应速度较快且测定方法操作简单，被广泛地应用于植物耐热性评价[7]。目前大多采用函数法对绿素荧光参数各指标进行分析[19]，其中的Fv/Fm值是用于植物耐热性评价的重要指标[20]。本研究的结果同样表明，矾根的叶绿素荧光动力学参数指标能够迅速响应45℃热胁迫处理，且会随着处理时间的不同发生变化。各个指标之间的相关性分析结果说明，Fv/Fm值可作为矾根叶绿素荧光动力学参数的代表性指标，用于不同矾根品种的耐热性评价。通过对37 个品种的分析认为，45℃热胁迫处理3 h 后矾根品种的Fv/Fm值可以作为评价矾根品种耐热性的最适指标，它与热害指数的相关性系数可达-0.893。本研究将直观的热害指数与能够早期响应热胁迫的Fv/Fm值相结合，通过两者之间的相互佐证，从表型和生理水平进行不同矾根品种耐热性的综合评价。据此建立起的矾根耐热性快速评价方法，不仅科学有效且操作更为简便。

在对许多物种的研究中均发现，高温胁迫处理会使得Fv/Fm值发生明显降低，且Fv/Fm值和高温胁迫时间呈负相关关系。例如，任少华等[20]发现兰科植物的Fv/Fm值和高温胁迫时间成显著负相关，说明兰科植物的光合器官在高温胁迫下受到了严重损伤。张方静等[10]通过测定月季在高温胁迫下叶绿素荧光参数发现，随着高温胁迫时间的增加，月季的Fv/Fm值均呈下降趋势，这说明其光合速率下降。本研究同样发现，经过45℃热胁迫处理，供试的37 个矾根品种的Fv/Fm值均发生了明显降低，说明高温胁迫使得矾根叶绿体受损，且受到胁迫的时间越长，其功能下降越明显。对杏树的研究显示，在6—9月的高温季节，‘苏勒坦杏’和‘小白杏’的Fv/Fm测定值均在气温最高的7月份出现最低值，且具有较高Fv/Fm值的‘苏勒坦杏’更能适应高温、强光环境[21]。周桂英等[9]通过对8 个品种叶绿素荧光参数的测定发现，耐热性较强的品种可以减弱Fv/Fm值下降的程度，并且认为Fv/Fm可作为大花蕙兰耐热品种筛选的可靠指标之一。与大花蕙兰中的研究结果一致，在高温胁迫下，耐热性较强矾根品种Fv/Fm值的下降程度明显较弱。随处理时间的增加，根据矾根品种Fv/Fm值变化情况可分为3 种类型：第一类表现为经6 h 热处理后Fv/Fm值仍可以维持在较高水平，大部分属于耐热性较强的矾根品种；第二类表现为经3 h 处理后Fv/Fm值已经呈现出较低水平，大部分属于耐热性较弱的矾根品种；第三类表现为在热处理6 h 内，Fv/Fm值随胁迫时间的增加而逐渐降低，大部分属于耐热性中等的矾根品种。推测产生这一现象的原因是耐热性较强的品种能够主动清除体内由于热胁迫而产生的自由基，从而减轻光合机构的损伤[22-23]，确切的机理还有待进一步研究。