广西甘蔗白条病的初步鉴定与病原菌分离

黄冬梅，李秋芳，周先瑶，颜梅新，宋修鹏，梁永检，王泽平，雷敬超，潘如科，张小秋

（1.广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室，广西 南宁 530007；2.荔浦市经济作物站，广西 荔浦 546600；3.广西南亚热带农业科学研究所，广西 崇左 532415；

4.平果市农业农村局，广西 平果 531400）

0 引言

甘蔗白条病是一种由白条黄单胞杆菌（Xanthomonasalbilineans（Ashby）Dowson）引起的细菌性维管束病害。蔗株染病后可引起全株甘蔗死亡，严重影响甘蔗产量。病发生严重时可使甘蔗产量损失10%~30%，且30%以上的蔗汁质量严重下降。该病害主要通过带菌种茎和砍收工具传播，蔗地一旦有植株发病，该病菌即可迅速传播蔓延［1-2］。据报道该病菌可用以下特异性引XAF：15'-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3'和XAR：15'-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3'；进行PCR扩增，得到片段长度为600bp的产物［3］。中国是世界第三大糖料蔗生产国，广西是我国第一产糖大省，年产糖量占全国65%以上［4］。2017年，Zhanget al.首次报道广西蔗区发生甘蔗白条病为害，在广西的北海、来宾和百色地区部分甘蔗品种（系）发生严重，高感品种桂糖46号和桂糖06-2081感病率达到18%～50%，甘蔗白条病的发生在广西蔗区有扩大趋势［5］。近年来，广西隆安县蔗区也出现疑似感染白条病的甘蔗植株，为了明确广西隆安县蔗区甘蔗植株是否感染白条病，本研究采集了该蔗区的疑似蔗株样品，进行PCR鉴定及病原菌分离培养，再回接至健康甘蔗植株，对发病情况进行观察和鉴定，旨在为今后深入研究甘蔗白条病病原菌及其与甘蔗互作奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集

于2019年11月，在广西隆安县广西农科院甘蔗研究所丁当试验基地甘蔗种植区，选取叶片表现出明显白色条纹病状特征的甘蔗植株，砍取整株甘蔗，将蔗茎分上、中、下后，置于放有冰袋的泡沫盒运输带回实验室，4℃冰箱保存备用。

1.2 病原菌分离

将维管束变红的蔗茎样品，用酒精火焰消毒砍刀，把蔗茎砍成节，再用蒸馏水把所取蔗茎的表面冲洗干净，接着用75%酒精对蔗茎进行表面消毒，然后用经过火焰消毒的砍刀把蔗茎去皮并切掉两端，转移至超净工作台中的灭菌牛皮纸上。用灭菌的剪刀剪去部分蔗茎，取污染源较少的中间部位，剪碎置于灭菌的1.5mL离心管中，再加入1mL灭菌蒸馏水，旋涡震荡1min，静置半小时。用移液枪取50uL液体涂布在XAS选择培养基［5］平板上，吹干水分，置于培养箱28℃培养5～8d，待菌落长出，用接种环挑单菌落再次在XAS选择培养基上划线纯化培养2～3d，从平板中挑取少量菌体放入5mL XAS液体培养基中，摇床过夜培养36～48h，然后取适量菌液加入等体积50%的无菌甘油，混匀后置于-80℃冰箱菌种保存。

1.3 PCR鉴定

1.3.1 DNA提取

按照细菌基因组DNA快速提取试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）的说明书提取病原菌基因组DNA或蔗茎和叶片DNA作为PCR模板，用于PCR鉴定。

1.3.2 PCR检测

利用文献报道的甘蔗白条病菌的特异性引物（XAF1：5'-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3'；XAR1：5'-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3'）对病原菌菌落基因组DNA进行PCR鉴定［2-3］。PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMixⅡ10μL、10μmol/L上下游引物各1μL、模板DNA 1μL，补足去离子无酶水至总体积为20μL。反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，65℃延伸1min，31个循环；65℃终延伸3min。取5μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，并以无菌蒸馏水为阴性对照、以魏春燕等［5］分离的甘蔗白条病菌的DNA作为阳性对照。

1.4 致病性鉴定

1.4.1 接种液制备

用250mL体积的三角瓶配制50mL XAS液体培养基，121℃高温灭菌20min。挑取少量经过PCR检测鉴定为阳性的菌落，接种到装有XAS无抗性液体培养基的三角瓶中，摇床28℃200rpm培养36～48h，制成母液。将母液用无菌水稀释配置成590nm波长下OD=0.18的接种菌液，用于后续实验。

1.4.2 接种

采用斩首法［6］接种甘蔗品种GT46的健康组培苗，即从甘蔗+1叶的叶耳处斩断头部，用移液枪取100μL制备好的接种菌液涂抹切口位置。共计接种20株甘蔗健康组培苗（5～6叶），用无菌水作为阴性对照。

1.4.3 致病性观察

接种后放置于温室中进行培养，分别在接种后10d、30d和50d对接种蔗苗进行观测并拍照记录其病症。

1.4.4 致病菌鉴定

接种50d后，采集植株+1叶，按1.3.1提取DNA，按1.3.2进行PCR检测。

2 结果与分析

2.1 大田蔗株病症

对田间疑似感染甘蔗白条病的蔗株进行观察。在蔗株幼苗期，发病较轻时，植株第1至第2张叶的叶色保持正常颜色，从第3张叶开始，其叶片边缘才出现条带状褪绿，白色条带跟主脉呈平行分布，主脉保持正常绿色，随时间推移，白色条带慢慢扩大，且靠近叶尖的白色带扩散速度快于叶片基部的白色带，可致整张叶片枯萎，如图1A所示；植株发病严重时，整株幼苗的叶片大部分或全部褪绿变白，且叶片细小，叶片卷曲，不能正常展开，幼苗出土后不久便枯死，如图1B和C所示。在蔗株成熟期，发病的植株叶片白化条基本都连带成片，一般是叶尖部先白化枯萎，叶基部保持部分绿色，如图1D所示，茎部侧芽萌发，且侧芽长出的新叶也变白，如图1E所示，其节和节间的维管束发红，随后不久整株就会枯死，如图1F所示。

图1 大田甘蔗感染白条病的病症

2.2 病原菌的分离与鉴定

培养6d后，XAS选择培养基平板上，开始长出菌落，菌落圆形，透明光滑，边缘圆整，不具流动性，有很淡的黄色，质地均匀，易挑取，如图2所示。

图2 XAS培养基上长出的菌落

利用甘蔗白条病菌的特异性引物对分离得到的菌落进行PCR扩增，得到片段大小约为600bp的目标产物，如图3所示，分离得到的菌落为白条黄单胞杆菌（X.albilineans），说明田间发病蔗株感染了白条病。

图3 菌落PCR扩增结果

2.3 致病性观察及鉴定

以分离鉴定后的菌落经XAS液体培养基培养后，配制成接种菌液，用斩首法接种甘蔗品种GT46的健康组培苗。接种10d后，有些植株叶片的边缘出现与叶脉平行的淡白色条纹，且切口处出现叶片坏死症状，如图4A所示；接种30d后，有些植株靠近生长点的部位出现白斑，叶片边缘出现内卷现象，如图4B所示；接种50d后，有些植株叶片叶尖部位枯死，叶片卷曲明显，甚至整张叶片枯死，如图4C所示。

图4 甘蔗GT46组培苗接种白条病菌后的病症

接种50d后，采集20株接种的组培苗的+1叶，利用白条病菌特异性引物对+1叶的DNA进行PCR扩增，除第2、3、7和20株没有检测到目标产物，其余都得到片段大小约为600bp的目标产物，说明接种成功。接种后50d后的PCR扩增结果，如图5所示。

图5 接种后50d后的PCR扩增结果

3 讨论

甘蔗是我国重要的产糖经济作物，栽培面积占我国常年糖料面积的85%以上，产糖量占食糖总产量的90%以上，甘蔗产业已成为主产区经济发展的重要支柱和农民增收的主要来源。国外有许多关于甘蔗白条病的研究报道，包括白条病的发生规律和危害症状、病原检测技术、传播途径以及防控措施等［7］。我国也有关于甘蔗白条病的研究报道，明确了广西北海、来宾、百色蔗区发现的疑似甘蔗白条病症状蔗株的致病病原为白条黄单胞菌，该菌可对甘蔗的产量和糖分造成严重损失，且有扩大蔓延的趋势［8-12］。本研究鉴定了广西隆安蔗区也遭受到白条病的侵害，说明白条病正在不断地扩大蔓延，正影响着广西甘蔗产业的发展。

本研究分离培养了白条病的病原菌，并采用柯赫氏法则回接验证病原菌的致病性。但发病程度并没有大田病症严重，可能是因为病原菌在蔗株体内积累的数量不够，该病潜伏期较长有关［1］。

据报道多数甘蔗属中国种抗白条病，多数热带种和大茎野生种感白条病，有学者初步筛选出一些抗病的甘蔗新品种（系），如桂糖40号、桂糖44号、桂糖08-120、桂糖08-1589、柳城07-150、粤甘46号、粤甘50号、云蔗11-3898、云蔗08-1609等，生产上可选用这些抗病品种进行品种布局，以防治白条病［12］。化学药剂可有效防治白条病，在发病初期及时选用1000~1200倍液的77%可杀得2000可湿性粉剂、3500倍液的72%农用硫酸链霉素、500倍液的50%代深铵水剂、4000倍液的新植霉素、350倍液的14%络氨铜水剂等药剂进行喷施，可有效防止甘蔗白条病的发生与流行［13］。