舒芬太尼对大鼠蛛网膜下腔出血后脑损伤的保护作用

周有东 马金阳 黄 松 胡火军 符常涛 袁 高 郭金满 汪 雷

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是多种因素引起的脑卒中的一个亚型，主要原因是颅内动脉瘤破裂，病死率高[1]。SAH后脑损伤指SAH后发生的一系列病理生理过程，包括颅内压增高、脑血流量和脑灌注压降低、血脑屏障受损、急性血管痉挛、脑水肿、神经炎症及神经元凋亡等[2]。研究发现活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累和氧化应激反应与SAH后脑损伤和继发性缺血性神经功能障碍密切相关[3]。临床研究发现，SAH后抗氧化相关酶减少，脂质过氧化物增加，与不良预后密切相关[4]。有研究应用舒芬太尼治疗脑出血[5]。本研究探讨舒芬太尼对大鼠SAH后脑损伤的保护作用及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组60只健康成年雄性SD大鼠，7～8周龄，体重250～500 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号[SCXK（鲁）2019-0003]。该研究经本院动物医学委员会批准，符合中国实验动物制度科学研究审查委员会关于动物实验的指导指南。60只大鼠随机分为假手术组、模型组和舒芬太尼组，每组20只。

1.2 动物模型建立及干预 参考文献[6]报道的方法制作SAH模型。SD大鼠适应性喂养2周后，用戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，结扎右侧颈外动脉和颈内动脉，剪断颈外动脉。4-0尼龙缝合线沿颈外动脉引入颈内动脉，直到感觉阻力（约18 mm），然后将缝合线再推进约1 mm穿透动脉，迅速撤出缝合线，结扎颈外动脉，缝合切口。假手术组仅将缝合线引入颈动脉分叉处感觉阻力时，拔出缝合线，不穿透动脉。舒芬太尼组造模后6 h，尾静脉注射舒芬太尼溶液，5μg/kg，1次/d，连续3周；假手术组和模型组尾静脉注射等量生理盐水。

1.3 神经功能评估 造模后1、2、21 d参考文献[7]报道的方法，采用改良神经严重性量表（modified neurological severity scale，mNSS）评分评估神经功能。评分范围0～18分，其中完全正常、无神经功能缺损评分为0分，意识丧失或死亡评分为18分。

1.4 脑水肿测定 末次神经功能评估结束后，每组取5只大鼠采用干湿重比法测定脑组织含水量。大鼠深度麻醉后，断头处死，迅速分离损伤灶半球脑组织，用滤纸吸干表面水分，称其重量为湿重；然后，置于105℃烤箱内24 h后称其重量为干重。脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.5 TUNEL染色检测神经元凋亡 末次神经功能评估结束后，每组取5只大鼠参考文献[8]报道的方法进行TUNEL染色。脑组织进行常规切片，PBS清洗，TritonX-100通透，严格按照TUNEL试剂盒（美国Invitrogen公司）说明进行操作。随机选取5个高倍镜（×400）视野观察，并计算细胞凋亡率。

1.6 EILSA测定氧化应激和炎症反应指标 末次神经功能评估结束后，每组取5只大鼠采用参考文献[9]报道的方法测定氧化应激和炎症反应指标。鼠深度麻醉后，断头处死，迅速左侧大脑半球组织放入无菌生理盐水中，匀浆后离心（12 000转/min离心20 min），取上清液。按照EILSA检测试剂盒（武汉赛培生物科技有限公司）说明操作，检测上清液肿瘤坏死因子-α（tumor neceosis，factor alpha，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷光甘肽过物氧化酶（glutathione peroxidase，GHS-px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量。

1.7 免疫印迹法检测相关蛋白的表达 末次神经功能评估结束后，每组取5只大鼠采用参考文献[10]报道的方法检测相关蛋白的表达。提取脑组织总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度。取40μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，然后转移至PVDF膜。用5%脱脂牛奶TBST封闭1 h，然后加入一抗[Nrf2（1:500），HO-1（1:500），NF-kB p65（1:500），BCL-2（1:500），cleaved-caspase-3（1:500）；美国Invitrogen公司]4℃孵育过夜，TBST冲洗4次，室温下加入二抗（1:1 000）。ECL试剂盒显影并拍照。采用ImageJ软件进行灰度值分析，以GAPDH作为内参对照。

1.8 统计学处理 采用SPSS 24.0 软件进行分析；定量资料以±s表示，用单因素方差分析和LSD-t检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 舒芬太尼对大鼠SAH后神经功能的影响 与假手术组相比，模型组大鼠mNSS评分显著增高（P＜0.001 ）。与模型组相比，舒芬太尼组大鼠mNSS评分显著降低（P＜0.01 ）。见图1。

图1 舒芬太尼对大鼠SAH后神经功能的影响

2.2 舒芬太尼对大鼠SAH后脑含水量的影响 与假手术组相比，模型组大鼠脑含水量显著增高（P＜0.001 ）。与模型组相比，舒芬太尼组大鼠脑含水量显著降低（P＜0.01 ）。见图2。

图2 舒芬太尼对大鼠SAH后脑含水量的影响

2.3 舒芬太尼对大鼠SAH后神经元凋亡的影响 与假手术组相比，模型组大鼠神经元凋亡率显著增加（P＜0.001 ）。与模型组相比，舒芬太尼组大鼠神经元凋亡率显著降低（P＜0.001 ）。见图3。

图3 舒芬太尼对大鼠SAH后神经元凋亡的影响

2.4 舒芬太尼对大鼠SAH后氧化应激和炎症反应的影响 与假手术组相比，模型组大鼠脑组织MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著升高（P＜0.01 ），SOD和GSH-Px水平显著降低（P＜0.01 ）。与模型组相比，舒芬太尼组大鼠脑组织MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著降低（P＜0.01 ），SOD和GSH-Px水平显著增高（P＜0.01 ）。见图4。

图4 舒芬太尼对大鼠SAH后氧化应激和炎症反应相关指标的影响

2.5 舒芬太尼对大鼠脑组织BCL-2、Nrf2、HO-1、NF-kB p65及cleaved-caspase-3蛋白表达的影响 与假手术组相比，模型组大鼠脑组织BCL-2、Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05 ），NF-kB p65和cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著增高（P＜0.05 ）。与模型组相比，舒芬太尼组大鼠脑组织BCL-2、Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著增高（P＜0.05 ），NF-kB p65和cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05 ）。见图5。

图5 舒芬太尼对大鼠SAH后氧化应激和细胞凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

SAH后脑损伤常伴有神经元凋亡和脑水肿，这是造成神经功能缺损的主要原因[11]。近年来，越来越多的研究集中于揭示脑损伤的分子机制。研究表明SAH后，脑组织发生多种病理性改变，包括脑缺血、血脑屏障破坏、脑水肿和细胞凋亡[12]。有研究发现，caspase抑制剂可以减少SAH后皮层细胞凋亡和基底膜caspase蛋白表达，改善神经行为功能和脑水肿[13]。caspase-3活化是导致细胞凋亡的关键步骤，但是却可以被BCL-2阻断。本研究发现舒芬太尼明显降低大鼠SAH后脑组织含水量、神经元凋亡率以及cleaved-caspase-3的表达水平，明显增高BCL-2蛋白表达水平。这提示舒芬太尼可能提高抑制caspase-3，缓解脑水肿，减少神经元凋亡。

越来越多的证据表明，神经炎症在SAH后脑损伤的发病机制中起关键作用，抗炎治疗有益于改善SAH[14，15]。在SAH早期，小胶质细胞过度激活可以分泌炎症因子，加重脑损伤，因此抑制小胶质细胞的激活可减轻SAH后脑损伤[16，17]。NF-kB是细胞内重要的核转录因子，参与机体的炎症反应，一旦被激活，促进炎症因子大量释放，从而导致炎症反应。另外，SAH会导致产生过多的活性氧和活性氮，包括羟自由基、超氧化阴离子、过氧化氢、一氧化氮和过氧亚硝酸盐，消耗了酶促和非酶促抗氧化剂防御系统[18]，导致氧化应激损伤[19]。本研究发现舒芬太尼明显抑制大鼠SAH脑组织NF-kB p65表达，显著降低炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平以及脂质过氧化产物MDA水平，显著增加抗氧化剂SOD和GSH-Px水平。这提示舒芬太尼对大鼠SAH后氧化应激反应和炎症反应具有抑制作用。

有研究表明在SAH大鼠模型中，苦豆碱通过Nrf2-ARE途径减少氧化应激损伤，改善神经功能[20]。Nrf2是抗氧化剂，能够调控细胞氧化损伤，而HO-1是Nrf2-ARE信号通路下游重要的抗氧化与解毒蛋白，对SAH后脑损伤具有减轻氧化应激损伤和抑制细胞凋亡的作用[21]。本研究发现舒芬太尼显著降低大鼠SAH脑组织Nrf2和HO-1蛋白表达；因此，我们推测舒芬太尼可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路缓解SAH诱导的氧化应激反应。

综上所述，舒芬太尼对SAH后脑损伤有保护作用，其机制可能其抗细胞凋亡、抗氧化应激和抗炎症反应等作用有关。