高温胁迫对猕猴桃叶片叶绿素荧光特性的影响

李化龙 王景红 张维敏 柏秦凤 张 焘 潘宇鹰 权文婷

(陕西省农业遥感与经济作物气象服务中心， 西安 710015)

引 言

猕猴桃为多年生落叶藤本植物，果实以其风味独特、富含维生素C而被誉为“水果之王”[1]。2019年中国猕猴桃种植面积达2.9×105hm2，产量为3×106t，种植面积和产量均居世界第1位。近年种植区域不断北扩南移，已发展到全国22个省份，其中陕西、四川、河南、湖南、贵州5省种植面积占全国85%以上，发展前景十分广阔。

猕猴桃原生境多为山地林下半阴生环境，空气湿润，温度变化缓和，弱光。由于商品化栽培历史短、品种更新大部分直接来源于野生环境，气候驯化不足，加之自身具有肉质根系分布浅、叶片肥大、气孔发达、蒸腾强烈的生理特点，决定了猕猴桃是一种抗逆性较弱的树种，集约栽培在平原地区的农田环境与其自然原生环境相差较大，农田阳光直射环境下常使树体温度过高，造成叶片、果实、树干伤害，影响猕猴桃的正常生长和开花结果，进而影响产量和品质。在气候变暖背景下[2-5]，猕猴桃主产区夏季高温天气时有发生，甚至出现40℃以上的极端高温天气，猕猴桃高温伤害尤为突出，叶片萎蔫、落叶、果实日灼、落果，甚至出现死树的现象。2013年江、浙、沪、皖等地遭遇高温灾害，35℃及以上天气持续40 d 以上，中华猕猴桃果实及叶片均遭受高温日灼伤害，叶片枯焦脱落，果实出现日灼病斑，严重减产；2016年立秋后，陕西省安康市出现50余天持续高温天气，最高气温达到42℃， 汉滨区恒口镇三条岭猕猴桃园落果率超过60%，50%植株整株死亡[6-8]。

近年来叶绿素快速荧光诱导动力学分析技术(JIP-test)已成为研究植物光合作用的有力工具，JIP-test的参数对环境胁迫尤其是高温胁迫非常敏感[9-11]，可无损伤地敏感感知植物生理状态与环境之间的关系，因此，JIP-test技术被称为测定叶片光合功能快速、无损伤的探针。Georgieva等[12]利用叶绿素荧光特性研究高温对豌豆叶片的影响，认为在45℃高温胁迫条件下表现出光合作用效率下降、光合电子传递受阻，严重高温胁迫还会造成放氧复合体、光系统Ⅱ(PSⅡ)供体侧和受体侧的伤害，尤其是对放氧复合体的伤害更为明显，导致叶绿素快速荧光诱导动力学(OJIP)曲线K相(照光后300 μs 处的特征位点)荧光出现显著增加；王振兴等[13]对软枣猕猴桃研究认为，JIP-test测定的相关参数能有效评价不同温度对软枣猕猴桃光系统活性的影响，其叶片最大光化学效率在35～48℃的范围内变化不明显，温度超过52℃时显著下降；钟敏等[14]探讨高温环境下叶绿素荧光特性的日变化，认为猕猴桃叶片中PSⅡ反应中心对高温较为敏感，且较易被高温损伤；杜国栋等[15]通过设置不同高温环境对仁用杏叶片PSⅡ光化学活性进行研究，认为高温损害PSⅡ供体侧和受体侧的功能，造成光合效率下降，是对叶片光合机构伤害的主要机制之一。迄今为止，从叶绿素荧光诱导动力学方面研究夏季高温胁迫对猕猴桃叶片光合功能影响的报道很少, 其相关荧光参数若能用于农作物热害程度识别，对农业气象灾害预测预警、灾害防御和评估具有重要意义[16-17]。本研究采取恒定高温胁迫处理方式对猕猴桃叶片进行高温模拟试验，利用JIP-test分析方法[18-21]，分析不同程度高温胁迫对猕猴桃叶片叶绿素荧光参数的影响，揭示猕猴桃叶片叶绿素对温度胁迫的反应特征，建立猕猴桃高温热害的识别指标，为猕猴桃气象灾害预测、预警、防御和评估方法等提供技术支持[22-24]。

1 材料与方法

1.1 研究区域

试验于2020年8月中下旬在陕西省周至县西安佰瑞猕猴桃研究院猕猴桃园(34.1°N，108.5°E，海拔457 m)进行，属秦岭北麓陕西猕猴桃主产区，该区是全球猕猴桃的最佳适宜生长区之一，猕猴桃种植面积达2.8×104hm2，年产猕猴桃鲜果为4.9×105t[25]。试验区年平均气温为13.2℃，最热月平均气温为26.1℃，极端最高气温为42.2℃，地面极端最高温度为69.2℃，年平均降水量为660 mm，属暖温带季风气候，以美味系猕猴桃为主要栽培品种。

1.2 试验设计

试验材料为树龄10年的美味系猕猴桃，品种为徐香，株行距为3 m×4 m,大棚架型栽培，中壤土，喷灌条件良好。

试验采用Yaxin-1162连续激发式叶绿素荧光仪测定叶绿素快速荧光诱导动力学曲线。

设置30℃，33℃，36℃，39℃，42℃，45℃，48℃，50℃，52℃，54℃共10个温度梯度，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h，3.0 h共6个时间梯度，其中30～48℃各处理的胁迫持续时间为0.5～3.0 h，50～54℃为1.0 h，以20～25℃环境温度下的测值为对照。胁迫温度由RR-CTC102C恒温控制箱实现。

选择叶片功能正常的一年生结果枝置于RR-CTC102C恒温箱内，叶绿素荧光仪探头由叶夹固定于箱内叶片上，分别于升温前(0.0 h)、达到设定温度后0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h，3.0 h各测定一次叶片叶绿素荧光。0.0 h处理测定前用遮光叶夹对猕猴桃叶片进行暗适应20 min。叶片在叶绿素荧光仪饱和脉冲光(2000 μmol·m-2·s-1)中暴露1 s后,测得0.01～1000 ms范围的完整叶绿素快速荧光诱导曲线。

1.3 数据分析与计算方法

参考Strasser等[19-20]的JIP-test计算方法，参考文献[26],本文由叶绿素快速荧光诱导曲线得到叶绿素荧光参数,见表1。

为比较不同温度处理下叶绿素荧光的差异，将不同时段内叶绿素荧光标准化为相对可变荧光[27-28]，并计算各温度处理与对照的荧光差异。

对0.01～1000 ms:

Vt=(Ft-FO)/(Fm-FO)，

ΔVt=Vts-Vtc；

(1)

对0.01～2 ms:

Wt=(Ft-FO)/(FJ-FO)，

ΔWt=Wts-Wtc。

(2)

其中，FJ为2 ms处的瞬时荧光强度；Fm为最大荧光强度；Ft表示t时刻荧光强度；Vt，Wt表示t时刻对应的相对可变荧光强度；Vts，Wts为不同温度胁迫下的相对荧光强度；Vtc，Wtc为常温条件下的相对荧光强度。

表1 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)分析中使用的术语和公式Table 1 Formulae and terms used in the analysis of OJIP fluorescence induction dynamics curve

2 结果与分析

2.1 不同高温胁迫下猕猴桃叶片OJIP曲线特征

2.1.1 高温胁迫对猕猴桃叶片OJIP曲线影响

不同温度处理后猕猴桃叶片的OJIP曲线形态变化显著(图1)。30℃，33℃(趋势相同，图略)及36℃温度胁迫下各处理与对照(0.0 h)的OJIP曲线形态无明显差异，曲线形状具有典型的OJIP曲线特征，表明PSⅡ尚未受到明显的高温伤害(图1)。胁迫温度升高至39℃，对照与处理之间的OJIP曲线形态开始发生显著变化：O相(照光后20 μs处的特征位点)在高温胁迫下较对照开始升高，P相(最大荧光时刻)较对照开始下降，曲线中J～I段趋于平缓。特别是在48℃温度胁迫下，J相(照光后2 ms 处的特征位点)、I相(照光后30 ms处的特征位点)拐点消失，曲线趋于变直，48℃持续时间3.0 h处理，J，I，P相均消失，表明光合电子传递过程严重受阻。高温胁迫0.5～3.0 h各处理之间的OJIP曲线差异不明显(图略)，表明猕猴桃叶片高温受害可能在0.0～0.5 h内已经发生。

图1 不同高温胁迫下猕猴桃叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线Fig.1 The fast chlorophyll fluorescence induction dynamics curve of kiwifruit leaves under different high temperature stress conditions

续图1

2.1.2 高温胁迫对猕猴桃叶片ΔVt影响

通过比较高温胁迫与对照相对可变荧光强度差值ΔVt发现(图2，3.0 h处理)，高温胁迫显著增加猕猴桃叶片叶绿素荧光诱导动力学曲线中K相和J相的相对可变荧光VK和VJ。VJ增加通常反映PSⅡ 受体侧的电子传递受到高温损伤[15]，ΔVJ值越大表示电子传递效率越低，表明高温胁迫使初级醌受体(QA)向次级醌受体(QB)的电子传递受到抑制；VK增加说明高温处理对光合机构放氧复合体(oxygen-evolving complex，OEC)活性产生较大影响[27]。

在30℃，33℃，36℃处理下，ΔVK，ΔVJ均小于零，表明此时猕猴桃叶片PSⅡ的受体侧和OEC尚未受到伤害(图2)；从39℃处理开始，在300 μs左右和2 ms左右特征位点处的叶绿素荧光产量开始增加(图2)，表明PSⅡ受体侧和OEC开始受到伤害；随胁迫温度升高，ΔVK，ΔVJ的正向增幅加大，48℃温度胁迫下，不仅ΔVK，ΔVJ达到最大，不同持续时间处理之间的差异也开始显现。

图2 高温胁迫对猕猴桃叶片ΔVt影响(ΔVK，ΔVJ和ΔVI为分别在300 μs，2 ms和30 ms处测定的ΔVt)Fig.2 Effects of high temperature stress on the relative variable fluorescence(ΔVt) for kiwifruit leaves (ΔVK，ΔVJ and ΔVI represent the relative variable fluorescence at t=300 μs，2 ms，30 ms，respectively)

续图2

2.1.3 高温胁迫对猕猴桃叶片ΔWt影响

用(FJ-FO)对可变荧光进行标准化，得到相对可变荧光变化曲线Wt(图3，3.0 h处理)，Wt为K相可变荧光占(FJ-FO)振幅的比例，反映PSⅡ放氧复合物的活性，其值随供体侧伤害程度的增加而增加[29-30]，常用于表征OEC受伤害程度，通过比较ΔWt的大小，可以计算出OEC受伤害程度。

由图3可知，在300 μs附近各处理与对照之间Wt出现最大差值，计为ΔWK。在30℃，33℃，36℃，39℃，42℃，45℃，48℃不同温度胁迫下，各处理ΔWK均大于零，表明即使在30℃弱温度胁迫下，猕猴桃叶片放氧复合体活性已经受到不利影响。33℃，36℃，39℃，42℃，45℃，48℃温度胁迫下各处理的ΔWK分别是30℃温度胁迫下ΔWK的1.6，2.0，2.6，3.4，3.9，5.4倍，表明随胁迫温度升高，各处理ΔWK呈指数增大。

图3 高温胁迫对猕猴桃叶片Wt及ΔWt影响Fig.3 Effects of high temperature stress on the relative variable fluorescence Wt and ΔWt for kiwifruit leaves

续图3

2.2 高温胁迫对猕猴桃叶片FO，Fm，Fa影响

2.2.1 高温胁迫对猕猴桃叶片初始荧光FO影响

FO是PSⅡ反应中心处于完全开放状态时(经过充分暗适应以后)的初始荧光强度。在高温胁迫下，植物体内叶绿素类囊体膜结构发生改变，首先反映为初始荧光FO的上升。FO增加量越多，类囊体膜受损程度就越严重。随温度升高，FO会在某一温度临界点突然上升[31]，表明反应中心受到破坏，因此，FO是检测热胁迫作用的生理指标[32-35]。图4表明30℃≤T<45℃时，猕猴桃叶片FO值随温度的增加和胁迫时间的延长变化不大；在45℃，FO荧光曲线出现突变临界点，表明胁迫温度大于45℃时，猕猴桃叶片叶绿素类囊体膜结构开始发生改变，温度胁迫使得PSⅡ反应中心开始出现失活状态。45℃≤T<50℃时，随温度升高FO呈明显增加趋势。50℃之后，FO基本维持高值。

图4 高温胁迫对猕猴桃叶片FO影响Fig.4 Effects of high temperature stress on FO of kiwifruit leaves

2.2.2 高温胁迫对猕猴桃叶片Fm影响

Fm是在饱和脉冲的强光照射下PSⅡ电子链上的电子由于迅速堆积而产生的最大荧光，表示PSⅡ接受光量子的最大能力，Fm下降是热耗散增加的标志。

Fm对温度变化比较敏感，其随温度变化的趋势表现出3个阶段性特征(图5)：30℃≤T<39℃时，Fm随温度升高下降幅度较缓；39℃≤T<45℃时，Fm随温度升高递减幅度加大；45℃≤T≤54℃时，Fm随温度升高降幅趋于平缓。

2.2.3 高温胁迫对猕猴桃叶片Fa影响

Fa表示PSⅡ最大光化学效率，反映PSⅡ反应中心内光能转化效率，是植物发生光抑制的敏感指标[35]。猕猴桃叶片PSⅡ最大光化学效率Fa随胁迫温度升高呈S型下降趋势(图6)：30℃≤T<39℃条件下，Fa随胁迫温度的升高和胁迫时间的增加无明显变化，基本维持在0.8以上的正常值；39℃≤T<45℃时，Fa随温度升高出现缓慢降低趋势，递减幅度0.02/℃，且随胁迫时间的增加不同处理的曲线表现为散发状态；45℃≤T<50℃时，随胁迫温度的升高Fa出现快速降低，递减幅度达到0.11/℃，是39℃≤T<45℃减幅的5.5倍，且表现为随胁迫时间延长降低幅度加大的趋势；当胁迫温度升高到50℃以上，Fa达到最低值，并趋于稳定。Fa随胁迫温度升高而下降表明叶片吸收的光能不能有效转化为化学能，PSⅡ反应中心出现光抑制现象。

图5 高温胁迫对猕猴桃叶片Fm影响Fig.5 Effects of high temperature stress on Fm of kiwifruit leaves

图6 高温胁迫对猕猴桃叶片Fa影响Fig.6 Effects of high temperature stress on Fa of kiwifruit leaves

2.3 高温胁迫对猕猴桃叶片单位面积能量流分配和反应中心密度影响

植物的光合器官对光能的吸收、转化和耗散等状况可以由比活性更确切地反映[36]。猕猴桃叶片单位面积捕获的光能(Tr)随胁迫温度升高表现为两段性的变化特点(图7)：30℃≤T<45℃时，Tr随胁迫温度升高表现为下降趋势，胁迫温度高于45℃后，Tr维持稳定少变状态。单位面积用于电子传递的光能(Et)随胁迫温度升高表现为三段性特征：30℃≤T<39℃时，各处理Et基本保持稳定；39℃≤T<45℃时，各处理Et下降迅速；胁迫温度高于45℃后，各处理Et随温度升高下降幅度减缓。单位面积用于热耗散的能量(Dd)随胁迫温度的升高呈现为两段性的变化特点：30℃≤T<45℃时，各处理Dd基本保持稳定；当胁迫温度超过45℃，各处理Dd随温度升高呈上扬趋势，且随胁迫时间的增加，Dd增加幅度显现出较明显的增加，表明胁迫温度超过45℃，光破坏防御机制开始通过热耗散消耗过剩光能。

单位面积活性反应中心密度(Rm)对温度胁迫响应较敏感，在整个高温控制试验范围内(30℃≤T≤54℃)随胁迫程度加强Rm直线减小，在45℃附近出现反应中心半衰温度点。温度胁迫持续时间对Rm的失活影响不明显(图7)。

图7 高温胁迫对猕猴桃叶片Tr,Et,Dd,Rm影响Fig.7 Effects of high temperature stress on Tr,Et,Dd,Rm of kiwifruit leaves

3 结论与讨论

综合猕猴桃叶片各类叶绿素荧光参数对不同程度高温胁迫的反应，得出如下结论：

1) 30℃≤T<39℃时，Tr，Rm，ΔWK等荧光参数受到影响，FO，Fm，Fa，ΔVK，ΔVJ，Dd，Et等荧光参数受影响较小，表明猕猴桃叶片PSⅡ在该温度范围发生轻微热抑制，可认定为轻度胁迫温度。

2) 39℃≤T<45℃时，除Tr，Rm，ΔWK等荧光参数受到影响外，FO，Fm，Fa，ΔVK，ΔVJ，Dd，Et等荧光参数受温度胁迫影响也出现剧烈变化，表明PSⅡ在该温度范围出现显著热抑制，可认定为中度胁迫温度。

3)T≥45℃时，Tr，Rm，ΔWK，FO，Fm，Fa，ΔVK，ΔVJ，Dd，Et等荧光参数均趋于峰值或降至谷值，表明PSⅡ在此温度条件下发生严重热伤害，这也与46℃经3.0 h处理后猕猴桃叶片开始出现焦斑的形态表现相一致，可认定为重度胁迫温度。

很多关于叶片高温胁迫导致PSⅡ结构和功能一系列变化甚至损害的结果表明:高温胁迫伤害叶绿素荧光参数程度不尽相同[37-39],敏感位点在较低胁迫温度下就开始表现出受伤害特征，次级敏感位点在较高胁迫温度下才相继受到伤害[40]。本研究的结果类似：对猕猴桃叶片，Tr，Rm，ΔWK在30℃≤T≤54℃时均受温度胁迫影响，属猕猴桃叶片光合机构敏感位点参数；FO，Fm，Fa，ΔVK，ΔVJ，Dd，Et具有在低温度胁迫下稳定少变、高温度胁迫下变化加剧的阶段性特征，属光合机构次敏感位点参数。陈贻竹等[31]的研究认为，黄瓜、水稻、甘蔗、仙人掌等植物FO的突变临界点温度在49～56℃，茄子的Dd在52℃开始出现大幅度增加[40]。本研究表明：猕猴桃叶片的FO，Dd均在45℃出现上升临界点，较上述研究结论明显偏低，这与猕猴桃抗逆性较弱的生理特性相符合。