溃疡性结肠炎患者肠道菌群紊乱与Th17/ Treg 平衡及相关细胞因子的关系

叶 佳 朱梅萍 刘 畅

上海中医药大学附属曙光医院脾胃病科，上海 201203

炎症性肠病（IBD）是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，而溃疡性结肠炎（UC）是IBD 常见类型，主要特点为结直肠黏膜弥漫、连续炎症改变，病变主要局限于黏膜下层和大肠黏膜[1]。研究认为，免疫失衡在UC 发病中扮演重要角色，以抗炎与促炎因子间失衡为主要研究方向[2]。T 淋巴细胞为机体重要免疫细胞，研究发现T 淋巴细胞激活后可释放多种血管活性物质和细胞因子，加重组织炎症反应，促进UC 发生和发展[3]。辅助性T 细胞17（Th17）和调节性T 细胞（Treg）是新近发现的CD4+T 淋巴细胞亚群，在多种免疫性疾病发生、发展中Th17/Treg 失衡及相关细胞因子的异常表达发挥重要作用[4]。有研究证实，UC 的发生和发展不仅与免疫调节功能紊乱有关，还与肠道菌群紊乱有关，是免疫损伤重要激发因素[5]。本研究就探讨UC 患者肠道菌群紊乱与Th17/Treg 平衡及相关细胞因子的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年7 月—2020 年7 月上海中医药大学附属曙光医院（以下简称“我院”）收治的30 例活动期UC（AUC）患者为AUC组，其中男14 例，女16 例；平均年龄（45.56±3.72）岁；1∶1 选取我院30 例缓解期UC（RUC）患者为RUC组，其中男15 例，女15 例；平均年龄（45.68±3.63）岁。纳入标准：①经病理检查确诊，符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018 年，北京）》[6]中AUC、RUC 诊断标准；②患者及家属均知情研究。排除标准：①妊娠及哺乳期妇女；②心、肝、肾功能损害；③近1 个月使用免疫抑制剂、激素、微生态制剂、抗生素；④完全性肠梗阻或不完全性肠梗阻。另选取同期30 名来我院体检健康者为对照组，其中男16 名，女14 名；平均年龄（44.57±3.87）岁；三组一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 肠道菌群数目检测 分别留取三组自然排出粪便1 g，粪便基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司；货号：D2700；规格：50T），反转录试剂盒（苏州宇恒生物科技有限公司；货号：R2043；规格：20 μL×100T）转录合成cDNA，加入细菌基因组DNA 引物，引物序列见表1，实时定量聚合酶链反应扩增，根据扩增曲线计算细菌数目，以lg n/g 表示。

表1 肠道菌群引物序列

1.2.2 外周血Th17、Treg、Th17/Treg比值测定抽取三组3mL空腹外周静脉血，密度梯度离心法获取单个核细胞，各管加入CD8a-异硫氰酸荧光素、CD3-藻红蛋白Cy5、白细胞介素（IL）-17 藻红蛋白，室温避光孵育30 min。加入100 μL 固定剂，孵育30 min，加入100 μL 破膜剂A，室温孵育15 min，磷酸缓冲盐溶液洗涤，800 r/min 离心6 min（半径13.5 min），收集细胞，加入100 μL破膜剂B 和IL-17 抗体，室温孵育20 min，磷酸缓冲盐溶液洗涤，磷酸缓冲盐溶液500 μL细胞重悬，贝克曼库尔DxFLEX 流式细胞仪测定Th17 占比。再抽取三组3 mL 空腹外周静脉血，加入10 μL CD127-藻红蛋白-Cy5、CD25-Cy5、CD4-异硫氰酸荧光素，室温孵育20 min，加入1 mL 溶血素，混匀后再加入磷酸缓冲盐溶液2 mL，1500 r/min 离心5 min（半径8 cm），弃上清，磷酸缓冲盐溶液500 μL细胞重悬，贝克曼库尔DxFLEX 流式细胞仪测定Treg 占比，并计算Th17/Treg 比值。

1.2.3 结肠黏膜组织中炎症因子表达水平测定 石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精洗去二甲苯，柠檬酸钠缓冲液抗原修复，使内部抗原决定簇暴露，3%过氧化氢浸泡10 min，封闭，加入稀释一抗4℃孵育12 h，冲洗后加入二抗室温孵育30 min，磷酸缓冲盐溶液冲洗3 次。二氨基联苯胺作用4 min，去离子水终止，高倍镜（400 倍）下取5 个视野，计算黏膜组织中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17 光密度值，以平均值为表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t 检验，多组间采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，计数资料以例数和百分率表示，采用χ2检验；Pearson 系数进行相关性分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组肠道菌群数目比较

AUC组肠球菌、肠杆菌数目明显多于RUC组、对照组，且RUC组高于对照组（P ＜0.05）；AUC组拟杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数目明显少于RUC组、对照组，且RUC组低于对照组（P ＜0.05）。见表2。

表2 三组肠道菌群数目比较（lg n/g，）

表2 三组肠道菌群数目比较（lg n/g，）

注：与对照组比较，ΔP ＜0.05；与RUC组比较，*P ＜0.05。UC：溃疡性结肠炎

2.2 三组外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比值比较

AUC组外周血Th17 细胞比例明显高于RUC组、对照组，且RUC组高于对照组（P ＜0.05）；AUC组Treg 细胞比例和Th17/Treg 比值明显低于RUC组、对照组，且RUC组低于对照组（P ＜0.05）。见表3。

表3 三组外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比值比较（）

表3 三组外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比值比较（）

注：与对照组比较，ΔP ＜0.001；与RUC组比较，*P ＜0.001。Th17：辅助性T 细胞17；Treg：调节性T 细胞；UC：溃疡性结肠炎

2.3 三组结肠黏膜组织中炎症因子表达水平比较

AUC组黏膜组织中IL-2、IL-6、IL-17 表达明显高于RUC组、对照组，且RUC组高于对照组（P ＜0.05）；AUC组IL-10 表达明显低于RUC组、对照组，且RUC组低于对照组（P ＜0.05）。见表4。

表4 三组结肠黏膜组织中炎症因子表达水平比较（μm2，）

表4 三组结肠黏膜组织中炎症因子表达水平比较（μm2，）

注：与对照组比较，ΔP ＜0.05；与RUC组比较，*P ＜0.05。IL：白细胞介素；UC：溃疡性结肠炎

2.4 UC 患者外周血Th17、Treg 及炎症因子与肠道菌群数目的相关性

Pearson 相关性分析显示，UC 患者外周血Th17、IL-2、IL-6、IL-17 与肠球菌、肠杆菌呈正相关，与拟杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌呈负相关（P ＜0.05）；Treg、IL-10 与肠球菌、肠杆菌呈负相关，与拟杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌呈正相关（P ＜0.05）。见表5。

表5 UC 患者外周血Th17、Treg 及炎性因子与肠道菌群数目的相关性（n=60）

3 讨论

UC 是消化系统疑难疾病，尽管目前UC 的确切病因不明，但近年有关免疫力和肠道菌群的研究兴起，发现UC 患者肠壁内存在明显过度免疫反应，引起肠道菌群抗原过度应答，导致消化道损伤，最终产生免疫损伤效应机制[7-13]。正常情况下，有超过500 种细菌定居于肠道，其中专性厌氧菌即生理性优势菌占菌群总量的99%，其余兼性厌氧菌即条件致病菌占1%，繁殖处于相对抑制状态[14-16]。Rosen 等[17]、Derikx 等[18]证实，UC 的发生与机体免疫和肠道菌群紊乱有关。Th17和Treg 为CD4+T 淋巴细胞亚群成员，其中Th17 表现为前炎性细胞亚类特征，Treg 表现为拮抗Th17 作用，二者细胞信号通路相互制约、交通，其平衡关系与机体免疫反应密切相关[19]。生理状态下，T 淋巴细胞倾向Treg 分化，以维持机体免疫耐受，但若在感染、炎症反应等病理状态下，可激活免疫系统，使T 淋巴细胞倾向Th17 分化，引起机体对自身抗原免疫反应[20-21]。本研究结果显示，三组外周血Treg 细胞比例逐渐降低，Th17 细胞比例和Th17/Treg 比值逐渐升高（P ＜0.05），提示UC 发生和发展有Th17/Treg 免疫失衡参与。结果显示，Th17 与肠球菌、肠杆菌呈正相关，与拟杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌呈负相关（P ＜0.05）；Treg与肠球菌、肠杆菌呈负相关，与拟杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌呈正相关（P ＜0.05），两者与肠道菌群间关系相反，进一步提示肠道菌群紊乱可能通过各种机制影响Th17/Treg 免疫平衡，进而参与UC 发生和发展。

Th17 细胞和Treg 细胞均为CD4+T 细胞亚群之一，Th17 细胞可分泌IL-2、IL-6、IL-17 等促炎细胞，能诱导炎症反应，Treg 细胞可调节IL-10 等抗炎细胞，发挥负向免疫调节作用[22]。本研究结果显示，三组黏膜组织中IL-2、IL-6、IL-17 表达逐渐升高，IL-10表达逐渐降低（P ＜0.05），提示免疫炎症反应参与了UC 发生和发展。结果还显示，IL-2、IL-6、IL-17 与肠球菌、肠杆菌呈正相关，与拟杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌呈负相关，IL-10 与肠球菌、肠杆菌呈负相关，与拟杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌呈正相关（P ＜0.05），推测肠道菌群紊乱可诱导Th17/Treg 免疫失衡，调节炎症介质参与UC 发生和发展。但目前尚不明确肠道菌群紊乱影响Th17/Treg 免疫失衡的机制，可能与以下几点有关。①肠道菌群可能通过基因直接影响能量代谢、分化方向等相关物理功能，影响Th17/Treg 平衡：如肠道菌群能作用于胸腺基质淋巴细胞生成素等受体，调控初始CD4+T 淋巴细胞向Th17 细胞或者Treg 细胞分化[23-24]。②肠道菌群可能通过能量代谢途径影响Th17/Treg 平衡：如共生菌产生的三磷酸腺苷酶可直接激动小肠固有层CD11、CD70 细胞，促进CD4+T淋巴细胞向Th17 细胞分化，影响Th17/Treg 平衡，也可通过抑制1 型调节性T 细胞生成，破坏免疫耐受，增加Th17 细胞数目[25]。乳酸菌可上调碳水化合物代谢和转运相关基因，当碳水化合物利用增加时，可增加参与葡萄糖和脂质代谢的短链脂肪酸含量，通过游离脂肪酸受体2 和3 通路增强免疫耐受，抑制免疫炎症反应[26]。③肠道菌群可能通过细胞因子途径影响Th17/Treg平衡：如分节丝状菌能通过肠上皮细胞中树突细胞抗原和淀粉样蛋白A 促进CD4+T 淋巴细胞向Th17 细胞分化；同时树突细胞可分泌IL-22，通过先天淋巴细胞通道增加IL-6、IL-22 分泌，增加淀粉样蛋白A表达，促进向Th17 细胞分化[27-28]。

综上所述，肠道菌群紊乱可能通过各种机制影响Th17/Treg 免疫平衡，调节炎症介质分泌，参与UC 发生和发展。但本研究样本量少，还需大样本前瞻性研究证实。