糖皮质激素受体基因NR3C1 rs7701443 和rs2963156 多态性与脑小血管病的相关性分析

李静雅 王 君 莫卫焱 任 歆 汪 琦 周卫东

1.应急总医院神经内科，北京 100028；2.北京市隆福医院神经内科，北京 100010

脑小血管病（CSVD）为一种环境因素和基因遗传共同作用的疾病，遗传因素在CSVD 的发生发展中起重要作用[1]。脑缺血后调节和影响炎症反应的糖皮质激素受体基因（NR3C1）多态性与CSVD 的相关性研究备受关注。van Rossum 等[2]研究认为NR3C1 ER22/23EK 位点多态性是CSVD 中脑白质病变保护因素。预研样本中未检出ER22/23EK，中国千人基因组里查找未发现ER22/23EK 突变型。国内研究发现[3]，（NR3C1）上rs7701443 和rs2963156 两个标签基因多态性与代谢综合征风险相关。在单基因位点分析中，SNP rs7701443 AA 和rs2963156 CT、CT/TT 与GG、CC比较，分别独立增加了代谢综合征的风险。另一项研究显示，rs7701443 位点AA 基因型携带者的体重指数（BMI）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）均高于GG+GA基因型携带者。rs2963156位点TT基因型携带者的腰臀比（WHR）、TC、LDL-C 等均低于CC+CT 基因型携带者。代谢综合征的危险因素及BMI、SBP、DBP、WHR等亦是CSVD 的危险因素。我国人群NR3C1 与CSVD的相关性尚不明确，因此，有必要对NR3C1 上基因位点进行多态性研究。本研究旨在分析中国北京地区汉族人群中NR3C1 rs7701443 和rs2963156 基因位点与CSVD 的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

CSVD组为2013 年3 月—2018 年5 月于应急总医院（以下简称“我院”）神经内科前瞻性研究[4-6]收集确诊为CSVD 的患者200 例，男74 例，女126 例，年龄（65.49±8.97）岁，均来自同一地区且非1 级亲属。入选标准：年龄50～85 岁，符合CSVD 诊断标准，诊断标准：按照《中国脑小血管病诊治专家共识2015》[5]。对照组为同期我院招募的年龄在50～85 岁，且经MRI 排除CSVD 的正常对照100 名，男33 名，女67 名，年龄（60.17±7.235）岁。本研究已获得我院医学伦理委员会批准，所有受试者均已签署知情同意书。两组均采用统一调查表。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 采集受试者静脉血1～2 mL，用北京博迈德基因技术有限公司全血基因组DNA 快速提取试剂盒（货号：DL101-01）严格按照说明书行DNA 提取。DNA 质检合格后，存放-20℃冰箱备用。

1.2.2 扩增引物设计和合成 从NCBI SNP 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）分别获得rs7701443和rs2963156 位点上下游约300 bp 序列。利用DNAMAN 序列分析软件设计两个SNP 位点的扩增引物：rs7701443 正向引物rs7701443-F（5’-ATTCTCTCCATTCATTCCTT-3’），反向引物rs7701443-R（5’-ATTTTCCTAACCTTAAACAC-3’）。rs7701443 变异位点距正向引物5’端109 bp，距反向引物5’端154 bp。rs2963156 扩增正向引物为rs2963156-F（5’-TAGTTGGATGAATTTAGGTG-3’），反向引物rs2963156-R（5’-GGGGTATTTTCCTGTAAGAA-3’）。rs2963156 变异位点距正向引物5’端234 bp，距反向引物5’端155 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR 扩增 采用天根生化科技（北京）有限公司高保真TIANSeq HiFi Amplification Mix（货号：NG219）对目的DNA 片段进行扩增。PCR 扩增体系：TIANSeq HiFi Amplification Mix 10 μL，10 μmol/L 正反向引物各1 μL，基因组DNA 50 ng，加ddH2O 至20 μL。94℃预变性10 min，94℃变性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35 个循环。然后72℃延伸2 min，16℃保存。PCR 扩增均在杭州博日科技股份有限公司Gene Explorer PCR扩增仪器[货号：TC-96/G/H（b）B]上完成。扩增结束后，吸取PCR 产物5 μL 进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 测序 PCR 产物送北京华大基因生物公司和北京诺赛基因组研究中心有限公司进行一代测序。一代测序采用双脱氧核苷酸链终止法在自动测序仪上进行，用Chromas 软件对测序峰图进行分析，根据测序峰图结果判定样品对应基因型。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0 软件对所得数据进行统计分析。计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验。相对风险率以优势比（odds ratio，OR 值）及其95%可信区间（confidence interval，CI）表示。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

遗传平衡检查：对2 个SNP 位点（rs7701443 和rs2963156）分别行Hardy-Weinberg 平衡吻合度检验，rs7701443 CSVD组χ2=0.014，P=0.993，对照组χ2=0.123，P=0.941。rs2963156 CSVD组χ2=1.127，P=0.569，对照组χ2=0.011，P=0.994。两组均具有符合Hardy-Weinberg 平衡，样本具有群体代表性。

2.1 rs7701443 多态性

2.1.1 两组rs7701443 等位基因频率比较 两组基因型频率和等位基因频率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 两组rs7701443 等位基因频率比较[例（%）]

2.1.2 排除CSVD 危险因素 排除高血压、冠心病、糖尿病等CSVD 危险因素影响后，两组基因型频率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。

表3 两组rs7701443 基因型频率比较（例）

2.2 rs2963156 多态性

2.2.1 两组rs2963156 等位基因频率比较 两组rs2963156 基因型频率和等位基因频率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表4。

表4 两组rs2963156 等位基因频率比较[例（%）]

2.2.2 排除CSVD 危险因素 排除高血压、冠心病、糖尿病等CSVD 危险因素影响后，两组rs2963156基因型频率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表5。

表5 两组rs2963156 基因型频率比较（例）

3 讨论

CSVD 危险因素的影响与以往研究一致[7-14]。本研究未发现NR3C1 两个标签基因位点rs7701443 和rs2963156 与CSVD 相关。

在CSVD 与候选基因多态性的相关性研究中[15]，至少存在36 个候选基因[4]。Tao 等[16]研究发现转化生长因子（TGF）-β1 rs1800470 对CSVD 的脑白质变性起保护功能。Shan 等[17]关于COX2 与CSVD 的相关性研究中示rs689466 和rs20417 对脑白质变性有保护性作用。Li 等[11]报道4 种候选基因（MYLK、AQP4、NINJ2 和INK4/ARF）中15个SNP与CSVD相关性研究，且rs2222823 杂合子和rs2811712 对CSVD 起保护作用。有研究提示[3,18]，rs7701443 和rs2963156 基因位点多态性与代谢综合征、心血管疾病中比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

本研究未发现这两种基因多态性与CSVD 的相关性，可能原因：人种不同；发病机制不同，CSVD 主要是小动脉、微动脉、内皮细胞受损导致，而代谢综合征、心血管疾病的发病机制多倾向于大动脉粥样硬化[19-25]；该两种基因多态性野生型基因频率低，多数为多态性基因型。因此，需要更大的样本量才可能达到统计学意义，或者等待更多研究报道后荟萃分析后得出明确结论。