次氯酸钠对德尔卑沙门氏菌生物被膜的抑制作用及机制

闫玉卿，张一敏，董鹏程，毛衍伟，梁荣蓉，朱立贤,*，罗 欣,2

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095）

沙门氏菌（Salmonellaspp.）是一种可以使人畜患病的革兰氏阴性肠道杆菌[1]，在肉类食品中的污染率较高[2]。沙门氏菌易引起高暴发率食源性疾病，威胁着人类的健康，2008—2015年间，我国因微生物导致的食物中毒事件占62.02%，其中沙门氏菌所引起中毒事件占比为23%，居于首位[3]。生物被膜是一种附着在接触表面上，由细菌和细菌分泌的细胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）共同形成的致密网络结构[4]。研究发现生物被膜是引起细菌污染的重要原因之一，由食源性致病菌引起的食物变质和生物被膜的形成已成为食品工业中的严重问题[5]。一般而言，生物被膜中的细菌比悬浮状态的浮游菌具有更高的抵抗环境胁迫（如干燥、紫外线或消毒剂）的能力[6]，因而对生物被膜的控制更加困难。沙门氏菌可以分为不同的血清型，不同地区的沙门氏菌血清型的流行程度不同，到目前为止，已经鉴定出2 600多种沙门氏菌血清型[7]。本课题组在2014年报道了我国肉牛屠宰环节沙门氏菌的检出率是6.5%，S. Derby是分离的野生菌株中主要的血清型之一[8]，且研究发现S. Derby在25 ℃条件下有较高的生物被膜形成能力[9]，因而本实验选取野生菌株S. Derby作为实验菌株进行生物被膜的探究。

生物被膜的形成机制复杂，与细菌的黏附、EPS产生、生物被膜内细胞代谢活性等密切相关。次氯酸钠具有良好的广谱杀菌活性，因其高功效和低成本成为食品工业中广泛使用的消毒剂[10]，在水中，次氯酸钠发生水解反应生成次氯酸，在灭活细菌方面比ClO－更有效[11]。据报道，次氯酸钠可氧化细菌蛋白质并导致细菌死亡[12]。深入了解次氯酸钠胁迫条件下沙门氏菌生物被膜的形成及其机制有助于提出更好的减少和消除食品行业生物被膜的策略。此前已有研究发现次氯酸钠对于生物被膜具有一定的控制效果[13-15]，但其作用机制尚不完全清楚，目前缺少定量评估次氯酸钠影响沙门氏菌生物被膜EPS含量、运动性以及微观结构等的报道。

因此，本研究将不同体积分数的次氯酸钠作用于S. Derby及其生物被膜，探究其对浮游菌的抑制作用以及对生物被膜的抑制和清除效果。此外，从生物被膜内细胞的代谢活性、细菌的泳动能力、EPS含量和微观结构方面分析不同体积分数次氯酸钠对它们的影响，以探究次氯酸钠对沙门氏菌生物被膜的抑制机制。本研究结果可以为肉类企业中生物被膜的消减提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

S. Derby分离自山东省肉牛屠宰厂[8]，由山东农业大学食品科学与工程学院畜产品加工实验室保存。

胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）液体培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）培养基、D/E中和肉汤培养基、葡萄糖、细菌琼脂粉、LB培养基 北京陆桥技术股份有限公司；氯化钠、结晶紫染料 国药集团化学试剂有限公司；10%次氯酸钠、95%乙醇 天津凯通化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4）、CCK-8试剂盒、刃天青 北京索莱宝科技有限公司；96 孔板、24 孔板、细菌培养板 美国康宁公司；BCA蛋白定量试剂盒 北京康为世纪生物科技有限公司；LIVE/DEAD荧光染液 美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

G154DWS灭菌锅 厦门致微公司；多道移液枪德国Eppendorf公司；Epoch2型酶标仪 美国 BioTek公司；HF safe-MJQ1型红外线灭菌器 上海力申科学仪器有限公司；LSM880激光共聚焦扫描显微镜 德国Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及生物被膜定量

将冻存于－20 ℃的S. Derby融解，接种于新鲜的TSB液体培养基中，在37 ℃下过夜培养18 h进行活化，经2 次活化后菌液浓度约为9（lg（CFU/mL）），备用。

将上述菌液在8 000×g、4 ℃下离心10 min，去上清液，无菌生理盐水重复洗涤沉淀2 次，使用无菌生理盐水调整菌液浓度至7（lg（CFU/mL）），在96 孔板中加入100 μL TSB培养液并接种100 μL上述菌液，以只加200 μL的新鲜TSB培养液作为阴性对照。每个样本重复6 个孔。96 孔板加盖后，放置在25 ℃培养箱培养7 d，期间每天对S. Derby生物被膜进行定量。

采用结晶紫染色法对生物被膜定量：弃去孔内培养液，用PBS冲洗3 次除去浮游菌，在室温下自然风干45 min。避光条件下每个孔中加200 μL结晶紫染液，避光染色30 min。弃去孔内染液，用PBS冲洗3 次除去多余染料，在室温下自然风干45 min。向每个孔中加200 μL体积分数95%乙醇溶液，洗脱与生物被膜定量结合的染液。30 min后使用酶标仪测定OD570nm[16-17]。

采用平板菌落计数法对生物被膜进行定量：弃去孔中的培养液，用200 μL无菌生理盐水清洗3 次后，用刮刀将生物被膜细菌刮下，200 μL无菌生理盐水重悬被膜，梯度稀释，用TSA平板计数[18]。

1.3.2S. Derby的最小抑菌浓度与最小杀菌浓度测定

使用TSB培养液通过二倍稀释法得到不同体积分数的次氯酸钠溶液，分别取100 μL添加到96 孔板中。采用1.3.1节中的方法将活化的菌液浓度调整为5（lg（CFU/mL）），取100 μL该菌悬液加入96 孔板中与次氯酸钠溶液混合，使次氯酸钠溶液的终体积分数分别为0.32%、0.16%、0.08%、0.04%、0.02%、0.01%、0，每个样本重复6 个孔。将96 孔板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。向每孔中加入10 μL 6.75 g/L的刃天青溶液（蓝色），然后在37 ℃的培养箱中培养18 h。孔中溶液颜色由蓝变红即为有细菌生长，未发生颜色变化的最低体积分数即为最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）[19]。将孔中混合菌液均匀涂布于TSA平板上，37 ℃培养24 h后无菌体生长的最低体积分数即为最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）[15]。

1.3.3 次氯酸钠抑制S. Derby生长曲线的测定

在96 孔板中加入100 μL TSB培养液，加入100 μL体积分数0.32%的次氯酸钠后依次二倍稀释。采用1.3.1节中的方法将菌液稀释至7（lg（CFU/mL）），并接种菌液至96 孔板内，使得孔中的次氯酸钠终体积分数分别为0（对照）、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，每个样本重复6 个孔。将96 孔板置于25 ℃恒温培养箱中培养24 h，每1 h取出使用酶标仪测其在600 nm波长处的OD值，收集数据，绘制生长曲线[20]。

1.3.4 次氯酸钠对S. Derby生物被膜的抑制率与清除率测定

按照1.3.3节中的方法制备含不同体积分数次氯酸钠的混合菌液，于25 ℃培养4 d。利用结晶紫染色法测得每个处理组在570 nm波长处的OD值，记为OD1，不含次氯酸钠的对照组记为OD0。次氯酸钠对生物被膜的抑制率按公式（1）计算[21]。

采用1.3.1节中的方法将活化的菌液浓度调整为7（lg（CFU/mL）），在96 孔板中加入100 μL TSB培养液并接种100 μL上述菌液，以只加200 μL的新鲜TSB培养液作为阴性对照。于25 ℃培养4 d（生物被膜达到成熟），弃去孔中的培养液，使用200 μL无菌生理盐水清洗3 次。分别加入200 μL体积分数为0（对照）、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC的次氯酸钠溶液静置处理15 min，吸出上清液；加入D/E中和肉汤培养基处理5 min后吸出上清液。使用刮刀将生物被膜细菌刮下，200 μL无菌生理盐水重悬被膜，梯度稀释，用TSA平板计数。每个样本重复6 个孔。次氯酸钠处理组计数为N1，对照组记为N0，次氯酸钠对生物被膜的清除率按公式（2）计算[22-23]。

1.3.5S. Derby泳动能力的测定

菌株泳动能力的测定采用软琼脂平板法，单一泳动平板的配方：质量分数0.3%琼脂、2.5 g/L葡萄糖、5 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨。群集泳动平板的配方：质量分数0.5%琼脂粉、0.5 g/L葡萄糖、25 g/L LB培养基。制作平板时加入次氯酸钠溶液，使得平板中次氯酸钠的最终体积分数分别是0（对照）、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC。将1.3.1节中活化的菌液取3 μL接种于两种平板的中心表面，在室温下放置20 min使菌液充分吸收；将单一泳动平板置于25 ℃下培养24 h，将群集泳动平板置于25 ℃下培养48 h，用游标卡尺测定菌株扩散圈的直径，每种平板重复3 次[24]。

1.3.6S. Derby生物被膜内细胞代谢活性的测定

按照1.3.3节中的方法制备含不同体积分数次氯酸钠的混合菌液，于25 ℃培养4 d。用PBS冲洗3 次，去除表面浮游菌，再向每孔加入100 μL PBS和10 μL CCK-8试剂，37 ℃培养4 h，测其在450 nm波长处的OD值。次氯酸钠处理组记为OD1，对照组记为OD0，次氯酸钠对S. Derby生物被膜内细胞代谢活性的抑制率计算见公式（3）[25]。

1.3.7S. Derby生物被膜胞外多糖、蛋白质量浓度测定

按照1.3.3节中的方法在24 孔板中制备含不同体积分数次氯酸钠的混合菌液共1 mL，于25 ℃培养2～4 d。收集24 孔板中生物被膜并重悬于1 mL无菌去离子水中，加入0.4 mL 1 mol/L NaOH溶液，在4 ℃条件下培养3 h，加入0.6 mL 0.85 g/100 mL NaCl溶液，6 000×g、4 ℃下离心20 min，使用0.45 μm滤膜过滤得上清液，对滤液进行EPS分析[26]。用苯酚-硫酸法测定胞外多糖质量浓度，建立葡萄糖标准曲线，在490 nm波长处测定吸光度。利用BCA蛋白定量试剂盒测定胞外蛋白质量浓度，建立蛋白标准曲线，在562 nm波长处进行比色分析。

1.3.8 激光共聚焦扫描显微镜观察

按照1.3.3节中的方法在细菌培养皿中制备含不同体积分数次氯酸钠的混合菌液，于25 ℃培养4 d。用无菌去离子水洗涤3 次去除浮游菌，晾干。在避光条件下，对生物被膜进行染色，避光染色30 min。试剂盒中的探针SYTO-9（激发波长485 nm、发射波长498 nm）与PI（激发波长535 nm、发射波长637 nm）能分别使活、死细胞在激光共聚焦显微镜下呈现绿、红荧光。而后使用无菌去离子水洗去多余的荧光染料，避光自然干燥，使用激光共聚焦扫描显微镜在63×油镜下观察[27]。

1.4 数据处理与统计分析

EPS采用SAS 9.0软件的混合模型进行交互作用分析。采用SPSS 20.0软件方差分析法对生物被膜定量、抑制率、清除率、代谢活性、泳动能力进行单因素方差分析。差异显著水平为P＜0.05，数据结果用平均值±标准偏差表示。使用Sigma Plot 12.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 S. Derby生物被膜的形成能力

生物被膜黏附于食品加工器械表面会产生交叉污染，造成巨大的损失。有研究发现细菌在微孔表面形成生物被膜的量与其在食品加工器械表面的生物被膜形成量呈显著正相关[28-29]，因此，本研究通过结晶紫染色法和平板菌落计数法测定S. Derby在微孔表面生物被膜的形成情况。

图1A、B分别为通过结晶紫染色法、平板菌落计数法测得的生物被膜形成能力。生物被膜形成量随着培养时间的延长而增多。在1～4 d生物被膜处于对数增长期，生物被膜形成量显著增加（P＜0.05），在第4天进入稳定期，达到最大黏附量（8.40（lg（CFU/mL））），生物被膜达到成熟，因此以第4天作为培养生物被膜成熟的时间点进行后续实验。

图1 S. Derby生物被膜在培养7 d过程中的形成量Fig. 1 Biofilm formation capacity of Salmonella Derby during 7-day cultivation

结果显示两种测定方法下生物被膜的变化趋势存在差异，这是由于生物被膜分泌的EPS易与结晶紫结合，因而结晶紫染色法主要以EPS的量来衡量被膜的生成量[30]；而平板菌落计数法是通过测定生物被膜中细菌的黏附量来衡量生物被膜的形成量。通过两种方法从不同角度来衡量生物被膜的形成能力，但均能得到随着培养时间的延长，S. Derby生物被膜的形成量呈现上升趋势的结论，这与Díez-García等[31]的研究结果一致。

2.2 次氯酸钠对S. Derby的MIC与MBC

由图2可以看出，当次氯酸钠体积分数为0.32%、0.16%、0.08%时，孔内的液体颜色没有变化，仍为蓝色，而体积分数为0.04%、0.02%、0.01%、0的4 个孔内液体明显变红，孔中没有颜色变化的次氯酸钠最小体积分数（MIC）为0.08%。通过将孔内菌液涂布平板计数后的结果得到次氯酸钠对S. Derby的MBC为0.08%（平板上单菌落小于5 个）。

图2 含不同体积分数次氯酸钠的S. Derby培养孔板Fig. 2 The culture plate of S. Derby with different concentration of sodium hypochlorite

本研究发现，次氯酸钠对S. Derby的MIC为0.08%，Rodríguez-Melcón等[15]研究发现次氯酸钠对于单增李斯特菌的MIC为0.32%，说明次氯酸钠对于不同的菌MIC不同。在工业上使用次氯酸钠消毒时体积分数通常为0.005%～0.020%，低于本实验所测的数值，这是由于本实验在稀释次氯酸钠时所用的是TSB液体培养基，而工业上是将次氯酸钠在水中稀释，TSB具有与次氯酸钠相互作用的有机成分，但是水不具有有机成分，因此次氯酸钠在水中的可用性更高[30]。

2.3 次氯酸钠对S. Derby生长曲线的影响

加入不同体积分数次氯酸钠后S. Derby在0～24 h的生长曲线如图3所示，MIC次氯酸钠能完全抑制浮游菌的生长，亚MIC（1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC）次氯酸钠处理组与对照组的生长曲线均在约4 h时从迟滞期进入对数增长期，其中次氯酸钠处理组浮游菌的增长速度与对照组相比较为缓慢。说明亚最小抑菌浓度次氯酸钠对于浮游菌的生长具有一定的抑制作用，反映了浮游菌对低浓度常用消毒剂的敏感性，结果为食品工业控制微生物提供了优化策略。

图3 不同体积分数次氯酸钠处理后S. Derby的生长曲线Fig. 3 Growth curves of S. Derby treated with different concentrations of sodium hypochlorite

2.4 次氯酸钠对S. Derby生物被膜的抑制和清除作用

如图4所示，加入不同体积分数的次氯酸钠后，S. Derby生物被膜的形成受到抑制。在MIC、1/2 MIC下，次氯酸钠对S. Derby生物被膜的抑制率分别达到了91.76%、90.26%，显著高于1/4 MIC、1/8 MIC次氯酸钠处理组（P＜0.05）；随着次氯酸钠体积分数的降低，其对生物被膜的抑制效果也逐渐减弱，当次氯酸钠为1/8 MIC时，其对S. Derby生物被膜的抑制率降为61.45%。Bansal等[30]的研究同样发现，当鼠伤寒沙门氏菌暴露于体积分数0.03%的次氯酸钠溶液中时，其生物被膜形成能力下降。在本研究中，MIC和亚MIC的次氯酸钠均对S. Derby生物被膜具有很强的抑制作用，其中次氯酸钠体积分数为MIC和1/2 MIC时的抑制率并无显著差异。浮游菌的生长仅在次氯酸钠体积分数为MIC时受到完全抑制，1/2 MIC条件下浮游菌保持较好的生长趋势，但生物被膜形成仍被明显抑制，可以推测次氯酸钠并非仅靠抑制浮游菌的生长来抑制生物被膜，需从细菌代谢活性、泳动能力、胞外物质等角度探明其抑制机制。此外，本研究旨在探究次氯酸钠对成熟阶段生物被膜的抑制效果，而生物被膜的形成是一个动态的过程。浮游细菌首先可逆地附着在接触表面，然后不可逆地结合在一起，这就导致了细菌细胞在表面的群落形成。在群体感应和其他信号分子的帮助下，生物被膜逐渐成熟并稳定。随后，生物被膜破裂，膜内的微生物释放分散到新的表面黏附定植[32]。因此，在确定抑制效果的基础上，将对次氯酸钠发挥抑制作用的具体阶段展开进一步的研究。

图4 不同体积分数次氯酸钠对S. Derby生物被膜的抑制率Fig. 4 Inhibitory rates of different concentrations of sodium hypochlorite on S. Derby biofilm

当前对于次氯酸钠抑制生物被膜的研究相对较少，更多的是对次氯酸钠清除生物被膜的研究。图5显示了不同体积分数次氯酸钠对于成熟S. Derby生物被膜的清除作用。次氯酸钠的清除效果随着体积分数的降低而减弱，2 MIC下清除率最高，达到了52.60%，显著高于1/4 MIC次氯酸钠处理组（P＜0.05），1/4 MIC下的清除效果显著低于其他3 个体积分数处理组（P＜0.05），清除率为22.03%。Gkana等[33]也证明了次氯酸钠对沙门氏菌生物被膜及沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的混合生物被膜具有显著的清除作用（P＜0.05）。此外，也有研究发现次氯酸钠对于单增李斯特菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌的生物被膜也具有清除作用，其中体积分数0.35%的次氯酸钠对单增李斯特菌生物被膜的清除率能达到90%以上[34]。本研究中次氯酸钠对S. Derby生物被膜清除率较低，也反映了生物被膜对于消毒剂的抗性。导致这一结果的原因可能是成熟的生物被膜具有较强的三维结构，并且EPS在膜内细菌中形成了一层保护屏障，因此更能耐受次氯酸钠处理[35]。在后续的研究中可以考虑将次氯酸钠与胞外物质分解酶类或植物精油等抑菌剂相结合，协同作用于生物被膜，以达到更好的抑制或清除效果[35-36]。

图5 不同体积分数次氯酸钠对S. Derby生物被膜的清除率Fig. 5 Scavenging rates of different concentrations of sodium hypochlorite on S. Derby biofilm

2.5 次氯酸钠对S. Derby生物被膜的抑制机制

2.5.1 次氯酸钠对S. Derby泳动能力的影响

生物被膜的形成经历了初始黏附、微菌落形成、成熟和分散4 个阶段。浮游细菌可逆地附着在接触表面称为初始黏附[32]，细菌的泳动能力在初始黏附过程中起着重要作用。泳动能力分为单一泳动和群集泳动，群集泳动是细菌的多细胞运动，它们以紧密结合的细胞群在固体基质上移动[37]。

表1显示了添加不同体积分数的次氯酸钠后S. Derby单一泳动和群集泳动能力的变化，经次氯酸钠处理后S.Derby单一泳动能力显著高于对照组（P＜0.05），由此可见次氯酸钠对于S. Derby单一泳动能力并无抑制作用，反而存在一定的促进作用；对于S. Derby的群集泳动，仅MIC下的群集泳动能力显著低于对照组（P＜0.05），说明次氯酸钠除体积分数为MIC时对S. Derby群集泳动有一定的抑制作用外，其他体积分数下均对群集泳动无显著影响（P＞0.05）。总体来说，次氯酸钠对于S. Derby的泳动能力没有抑制作用，因而可以推断次氯酸钠并未通过影响S. Derby的泳动能力来抑制其生物被膜的形成。

表1 不同体积分数次氯酸钠对S. Derby生物被膜泳动能力的影响Table 1 Effects of different concentrations of sodium hypochlorite on swimming mobility of S. Derby biofilms

2.5.2 次氯酸钠对S. Derby生物被膜内细胞代谢活性的影响

生物被膜的形成与其中代谢活性细胞的发展有关，细胞在发育期间进行线粒体呼吸[21]。CCK-8试剂中含有水溶性四唑盐WST-8，WST-8在电子载体的作用下能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臢物，生成的甲臢物数量与活细胞数量成正比，通过酶标仪测量细胞液的OD405nm，便可检测出待测细胞样品的代谢活性[38]。

如图6所示，次氯酸钠对S. Derby生物被膜中细胞代谢活性具有较好的抑制效果。不同体积分数次氯酸钠对S. Derby生物被膜中细胞代谢活性的抑制率差异显著（P＜0.05），随着次氯酸钠体积分数的升高，抑制率显著升高（P＜0.05）。其中1/8 MIC次氯酸钠的抑制率为65.19%，MIC次氯酸钠的抑制率达到93.88%。代谢活性实验结果显示次氯酸钠能明显降低生物被膜内细胞代谢活性，从而可以进一步推测，抑制细胞代谢活性是次氯酸钠抑制生物被膜的原因之一。

图6 不同体积分数次氯酸钠对S. Derby生物被膜内细胞代谢活性的抑制率Fig. 6 Inhibitory rates of different concentrations of sodium hypochlorite on biofilm metabolism of S. Derby biofilms

2.5.3 次氯酸钠对S. Derby生物被膜胞外多糖和蛋白的影响

由表2可以看出，对照组中S. Derby生物被膜的胞外多糖质量浓度随培养时间的延长而显著上升（P＜0.05），次氯酸钠处理组在相同培养时间内的S. Derby胞外多糖质量浓度显著低于对照组（P＜0.05），由此可见，在培养2～4 d的过程中，次氯酸钠均对S. Derby胞外多糖的产生有抑制作用，其中MIC时的抑制效果最好。

表2 不同体积分数次氯酸钠对S. Derby生物被膜胞外多糖的影响Table 2 Effects of different concentrations of sodium hypochlorite on extracellular polysaccharides of S. Derby biofilms

由表3可知，次氯酸钠处理组与对照组的S. Derby胞外蛋白质量浓度都随着培养时间的延长而升高，在相同培养时间内，不同体积分数次氯酸钠处理组的S. Derby胞外蛋白质量浓度均与对照组无显著差异（P＞0.05），由此可知，次氯酸钠不能抑制S. Derby胞外蛋白的产生。

表3 不同体积分数次氯酸钠对S. Derby生物被膜胞外蛋白的影响Table 3 Effects of different concentrations of sodium hypochlorite on extracellular proteins of S. Derby biofilms

EPS是生物被膜的重要组成部分，胞外多糖、胞外蛋白等共同组成生物被膜的三维立体结构[39]。在本研究中，随着培养时间的延长，生物被膜内的胞外多糖和蛋白的质量浓度也相应增加，这与利用结晶紫染色法对生物被膜定量的结果相一致。纤维素、脂多糖等多糖成分可以支持细胞间的相互作用，介导生物被膜的三维结构生成，在培养基中添加不同体积分数的次氯酸钠后，生物被膜中的胞外多糖质量浓度显著降低（P＜0.05），这表明次氯酸钠主要通过抑制胞外多糖的生成来抑制生物被膜形成三维结构。卷曲菌毛、鞭毛等蛋白成分是细菌泳动和黏附的主要组件[40]，加入次氯酸钠后生物被膜中胞外蛋白的质量浓度没有显著变化（P＞0.05），也印证了次氯酸钠对于细菌的泳动能力没有影响。纤维素由bcsABZC-bcsEFG基因编码[41]，卷曲菌毛由csgA、csgD等基因编码[42]，次氯酸钠对胞外多糖和胞外蛋白的抑制情况不同，可能是由于其对于编码胞外多糖和胞外蛋白的基因表达产生了不同的影响。此外，沙门氏菌生物被膜还受菌体内在的诸多基因和群体感应的调控[32]，需要进一步从基因表达和群体感应调控的角度研究次氯酸钠抑制沙门氏菌生物被膜形成的机制，目前相关研究正在开展进行中。

2.5.4 激光共聚焦扫描显微镜观察S. Derby生物被膜结果

图7 S. Derby生物被膜的激光共聚焦扫描显微镜图Fig. 7 CLSM images of S. Derby biofilms

通过激光共聚焦扫描显微镜三维光学成像，对不同体积分数次氯酸钠处理下S. Derby生物被膜进行了分析和比较。图7是对照组与次氯酸钠处理组S. Derby生物被膜的激光共聚焦显微图像，图中绿色代表活菌，红色代表死菌，立体图可以展现生物被膜的厚度。对照组的显微图像显示生物被膜中的细菌呈现团状聚集，活菌数量远远大于死菌，生物被膜厚度较高。在次氯酸钠处理组中，MIC下细菌量较少，且均为死菌，随着处理的次氯酸钠体积分数降低，活菌数量增加，死菌数量减少，细菌逐渐聚集，生物被膜厚度也增加，但仍远小于对照组。与前面次氯酸钠抑制沙门氏菌生物被膜的形成（图4）的结果相一致。显微镜观察结果显示出沙门氏菌有较强的成膜能力，这一结果与Sadekuzzaman等[43]报道的结果一致。本研究也表明S. Derby生物被膜对目前工业中常规使用体积分数（0.01%、0.02%）的次氯酸钠具有一定的耐受性。这可能是沙门氏菌在食品接触面定植和引起交叉污染的原因，需要进一步寻找对沙门氏菌生物被膜具有更有效抑制和清除作用的措施。

3 结 论

沙门氏菌污染对于食品工业是一个重大的安全隐患，探究不同体积分数和类型的食品级消毒剂对该细菌的影响对优化控制食品加工环境中安全问题尤为重要。本研究表明，次氯酸钠对S. Derby的MIC为0.08%，在该体积分数下S. Derby的生长完全受到抑制，对生物被膜的抑制率达到91.76%；亚MIC（0.04%、0.02%、0.01%）次氯酸钠对S. Derby生物被膜也具有明显的抑制作用。不同体积分数的次氯酸钠均能降低S. Derby生物被膜内细胞的代谢活性，减少胞外多糖的生成，激光共聚焦扫描显微镜结果也进一步印证了次氯酸钠处理减少了生物被膜的生成量及活菌数。因此，本实验所探索的次氯酸钠抑制S. Derby生物被膜的形成机制主要有：延缓浮游菌的生长、降低生物被膜内细胞代谢活性、减少生物被膜胞外多糖的合成及生物被膜内菌体的数量。