染色体核型分析联合荧光原位杂交技术对儿童急性髓系白血病M2的诊疗意义

李林飞，宋银森，李东晓，李娴，赵鼎

（郑州大学附属儿童医院 河南省儿童遗传代谢性疾病重点实验室 郑州儿童医院，河南 郑州 450000）

急性髓系白血病M2型(acute myeloid leukemia-M2,AML-M2)是一类髓系造血干/祖细胞恶性克隆性疾病，其致病基础主要是细胞及分子遗传学异常[1]。t(8;21)是急性髓系白血病M2的一种常见非随机染色体重排，具有较强的规律性[2]，其易位的产生导致AML1基因重排可作为急性髓系白血病M2基因诊断的标志。核型分析和FISH技术是常用的白血病检测的遗传学手段，本研究旨在深入探讨两种方法在AML-M2诊治及预后中的应用价值及方法学特点。

1 资料与方法

1.1 对象2017年7月至2019年3月在我院血液肿瘤科住院的急性髓系白血病M2型儿童25例，男10例，女15例，均经FAB骨髓形态学及免疫学分型等标准确诊。本研究通过郑州儿童医院伦理委员会批准，并均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 染色体核型分析 在无菌条件下,抽取患儿骨髓液至少3ml，肝素锂管抗凝，接种于淋巴细胞培养基中，37℃培养2天左右。加入秋水仙素后继续培养数小时后收获，常规制备染色体玻片，G显带，分辨率400～450条带。用Leica GSL-10全自动工作站，计数20个分裂相，分析5个左右核型，当核型结果不一致时，根据相关标准扩大计数量并加数核型。按照人类细胞遗传学国际命名体制ISCN2009加以描述。

1.2.2 荧光原位杂交技术 应用荧光原位杂交(FISH)检测，采用AML1/ETO双融合基因探针(英国Cytocell公司),ETO(8q22)基因探针标记为绿色，AML1(21q22)基因标记为红色。在Leica GSL-10全自动工作站荧光显微镜下观察间期细胞杂交信号,Cytovision软件进行荧光图像分析，共计数200个细胞杂交信号，阳性细胞所占比例达10%以上可提示阳性结果。正常细胞内显示的杂交信号为2个绿色及2个红色信号，均不在同一点上，无融合信号发生；发生AML1/ETO融合的阳性细胞内至少显示一个以上黄色融合信号。

1.3 统计学方法 数据处理采用SPSS21.0统计软件，两种方法学比较采用卡方检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

在25例AML-M2儿童中，核型分析检出t(8;21)染色体易位17例(68%)，包括除典型t(8;21)及其它染色体异常，如复杂易位、缺失、额外染色体等，核型正常5例(20%),其中4例为复诊儿童,3例(12%)标本因细胞生长不良，制片质量差，无法分析；25例AML-M2儿童同时做FISH，检出阳性20例(80%)，包括17例t(8;21)及3例无分裂相的标本，4例复诊儿童均为阴性，检出信号异常1例(4%)，但无阳性改变。17例AML-M2儿童易位染色体核型见表1。

表1 17例AML-M2儿童易位染色体核型分布

本研究中染色体核型分析对t(8;21)的检出率与荧光原位杂交(FISH)对AML1/ETO融合基因的检出率进行比较，差异并无统计学意义（χ2=0.936，P=0.333)，见表2。

表2 两种方法检出率比较

3 讨论

伴t(8；21)染色体易位或AML1-ETO融合基因阳性急性髓系白血病已被世界卫生组织划分为独立亚型,出现在约10%～20%儿童急性髓系白血病病例中[3]，为目前儿童AML最常见的分子细胞遗传学改变，具有高度的异质性[4],临床表现有发热、鼻衄、面部苍白、皮肤瘀斑、黏膜出血点、血象异常等，多见髓外侵犯,常伴有附加核型异常[5]。

t(8；21)/AML1-ETO融合基因阳性常见于儿童AML的FAB分型中M2型，尤其在M2b亚型中出现率高达80%以上，M1,M4亦可见，偶见于骨髓增生异常综合症（MDS）[6]。M2b主要是以异常的中性中幼粒细胞为主[7]，因此类患者化疗完全缓解率较高，生存期也较长，其被认为是预后良好组。分子及细胞遗传学检测对于AML-M2临床诊治及预后具有重要的临床意义。

AML1/ETO融合基因是由于21号染色体上的急性白血病因子(acute myelogenous leukemia factor1,AML1 or RUNX1)基因易位至8号染色体上的白血病易位基因（myeloid translocation gene,ETO）而产成[8]，这种遗传学改变形成融合转录本RU NX1-RUNX1T1，破坏了核心结合因子复合物的α亚基，进而产生AML1/ETO融合蛋白，该融合蛋白能够对正常造血细胞的增殖、分化和凋亡产生干扰,从而构成了t(8;21)阳性AML发病的重要基础[9]。

本研究25例AML-M2儿童G显带检出t(8；21)染色体易位17例(68%)，核型正常5例(20%)，且有3例(12%)标本因细胞生长不良，制片质量差，无法分析。而FISH检测不受细胞培养条件及实验室环境影响，可以分析处于各个分裂期的细胞，只需观察荧光信号均可做出结果判读,大大降低结果分析的难度，检测方法更加客观、特异、省时[10]。对于17例t(8;21)染色体易位及3例无分裂相的标本,FISH检测均提示阳性,表明FISH探针检测用于AML-M2诊断较染色体核型分析有一定技术优势,能够降低漏检率特别是对于无分裂相或分裂相稀少不足以显示克隆性染色体重排的病例,进而为临床诊断和治疗提供重要信息。但本研究中两种方法的检出率比较，差异并无统计学意义，可能跟此易位染色体相关白血病染色体畸变G显带技术较易检出及标本量有关。此外，4例复诊儿童，FISH结果均为阴性,表明FISH检测在AML-M2预后的疗效监测中同时具有一定用途。

综上所述,急性髓系白血病M2患儿特异性t(8；21)/AML1-ETO融合基因阳性改变较易检出，FISH技术检测患儿易位的敏感性较高于染色体核型分析。FISH检测不仅可以提示融合基因是否阳性,也可提示特定基因是否异常。染色体核型分析可同时提示相关染色体是否易位及其余染色体有无畸变。因此，两种分析方法联合应用可多方面提示AML-M2儿童的疾病信息,在AML-M2的诊治及预后中具有重要的应用价值。