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一测多评法同时测定金花清感颗粒中6种成分的含量

2021-07-29刘庆焕王文彤

天津药学 2021年3期
关键词:牛蒡甘草酸绿原

刘庆焕,张 岩,傅 予,张 婷,王文彤

(天津市医药科学研究所,天津 300020)

金花清感颗粒由金银花、石膏、蜜麻黄、炒苦杏仁、黄芩、连翘、浙贝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷、甘草组成,具有疏风宣肺、清热解毒之功效[1],主要用于单纯型流行性感冒轻症,为COVID-19治疗的推荐中成药[2],通过临床疗效的同步观察,对于轻度及普通型患者疗效确切[3]。

中药制剂均为多组分复杂体系,单一检测指标难以全面准确评价其质量,多指标控制模式已逐步应用于中药制剂的质量控制中,然而传统的多指标评价模式存在对照品数量众多、价格昂贵等不足。一测多评法(quantitative analysis of multi-components by single marker,QAMS)是以样品中某一典型成分为内参物,建立内参物与其他待测成分间的相对校正因子,计算其他待测成分的含量,实现多种成分同时测定的同时,降低了检测成本[4-5]。目前,关于金花清感颗粒的研究多集中在药理作用、临床观察等方面[3,6-8],而对其质量评价方面的研究未见文献报道。本研究以黄芩苷为内参物,建立同时测定金花清感颗粒中黄芩苷、绿原酸、芒果苷、牛蒡苷、汉黄芩苷和甘草酸铵含量的一测多评方法,以期为金花清感颗粒的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1260型高效液相色谱仪;岛津LC-20AT高效液相色谱仪;色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);AB135-S型十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多公司);KQ-520B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 乙腈、甲醇(色谱纯,Sigma科技有限公司);甲醇、乙醇、磷酸(分析纯,天津市化学试剂供销公司);绿原酸对照品(批号110753-201716,质量分数99.3%)、黄芩苷对照品(批号110715-201318,质量分数93.3%)、甘草酸铵对照品(批号110731-201720,质量分数97.7%)购于中国食品药品检定研究院;芒果苷对照品(MUST-18040123,质量分数98.2%)、牛蒡苷对照品(批号MUST-20041510,质量分数98.8%)购于成都曼斯特生物有限公司;汉黄芩苷对照品(批号19101501,质量分数99.5%)购于成都康邦生物科技有限公司;金花清感颗粒[规格:5 g/袋,批号分别为20200224、20200122、20200116,聚协昌(北京)药业有限公司];水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),按表1进行梯度洗脱;柱温25℃;体积流量1.0 ml/min;进样量10 μl;检测波长:0~9 min,327 nm(绿原酸);9~20 min,254 nm(芒果苷);20~54 min,277 nm(黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷);53~75 min,254 nm(甘草酸铵)。理论塔半数按黄芩苷峰计算不低于6 000。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 取绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷和甘草酸铵6种对照品适量,精密称定,置于25 ml棕色量瓶中,加70%甲醇制成每1 ml含绿原酸49.8 μg、芒果苷20.5 μg、黄芩苷228.4 μg、牛蒡苷410.2 μg、汉黄芩苷74.0 μg和甘草酸铵49.3 μg的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液5 ml,置于10 ml棕色量瓶中,加入70%甲醇振摇后定容至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取供试品适量,研细,取约0.2 g,精密称定,置于50 ml具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇20 ml,密塞,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液过0.45 μm微孔滤膜,即得。

2.3 方法学考查

2.3.1 系统适用性试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂,按“2.1”项下色谱条件测定,见图1。供试品色谱中在与混合对照品色谱中绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵相应位置位上均有色谱峰出现,且色谱峰之间的分离度均大于1.5,理论塔板数均大于7 000,满足含量测定的要求。

图1 混合对照品(A)供试品(B)空白溶液(C)HPLC图

2.3.2线性关系考查 取“2.2.1”项下混合对照品储备溶液1、2.5、5、7.5和10 ml置于10 ml量瓶中,加入70%甲醇定容至刻度,摇匀,即得系列浓度对照品溶液。分别吸取10 μl注入液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件测定,以对照品浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,得到各待测成分的回归方程及线性范围见表2。结果表明各成分在各自的浓度范围内线性关系良好。

表2 金花清感颗粒6种成分线性关系考查结果

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1”项下混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,记录色谱图。计算绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵峰面积的RSD值分别为0.35%、1.41%、0.65%、0.18%、1.13%和1.07%,表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取金花清感颗粒样品(批号20200122),按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,分别于配制后0、3、6、9、12和24 h按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。计算绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵含量的RSD值分别为0.90%、2.08%、0.36%、0.52%、0.14%和0.69%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验 取同一批号金花清感颗粒样品(批号20200122)6份,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。计算绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵含量的RSD值分别0.90%、0.91%、0.17%、0.26%、0.18%和0.08%,表明该方法的重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取已知6种成分含量的金花清感颗粒样品(批号20200122)约0.1 g,共6份,精密称定,分别按对照品加入量与供试品中待测成分含量的比为1∶1加入绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵对照品,按照“2.2.2”项下方法制备加样回收供试品,按“2.1”项下色谱条件进样测定,计算加样回收率及RSD。结果绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵的加样回收率分别为98.00%、101.07%、97.69%、96.92%、96.79%和102.11%,RSD值分别为1.53%、1.78%、1.37%、1.62%、1.68%和1.67%,表明该方法的准确度良好。结果见表3-8。

表3 绿原酸加样回收率试验结果(n=6)

表4 芒果苷加样回收率试验结果(n=6)

表5 黄芩苷加样回收率试验结果(n=6)

表6 牛蒡苷加样回收率试验结果(n=6)

表7 汉黄芩苷加样回收率试验结果(n=6)

表8 甘草酸铵加样回收率试验结果(n=6)

2.4 一测多评法

2.4.1 相对校正因子 取“2.3.2”项下系列对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,以黄芩苷为内参物,按公式fsi=fs/fi=(As/Cs)/(Ai/Ci)计算相对校正因子,式中As为内参物对照品s峰面积,Cs为内参物对照品s浓度,Ai为某待测成分对照品i峰面积;Ci为某待测成分对照品i浓度[4]。结果见表9。

2.4.2 耐用性考查 取“2.2.1”项下混合对照品溶液,分别考查不同型号色谱仪和不同型号色谱柱对相对校正因子的影响。结果表明不同高效液相色谱仪及色谱柱对相对校正因子无显著影响(RSD<3%),见表10。

表10 不同仪器和不同色谱柱待测成分的相对校正因子

2.4.3 色谱峰定位 以内参物黄芩苷色谱峰为基准峰,采用相对保留时间值法对待测目标成分色谱峰进行定位,分别计算待测成分绿原酸、芒果苷、牛蒡苷、汉黄芩苷和甘草酸铵的相对保留时间(RRT)。计算公式:r=tRi/tRs,tRi为待测物i的保留时间,tRs为内参物s的保留时间。考查各待测成分RRT在不同高效液相色谱仪和色谱柱中的重现性。结果表明各待测成分RRT波动较小(RSD<3%),表明用相对保留时间法对色谱峰定位是可行的,见表11。

表11 不同仪器和不同色谱柱待测成分的相对保留时间

2.4.4 样品含量测定 取3批金花清感颗粒按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”色谱条件进样测定,分别采用外标法和一测多评法计算样品中绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵的含量,结果见表12。将2种方法计算结果经相关系数分析,结果2种方法之间的相关系数均大于0.999 9,2种方法计算得含量结果基本一致,t检验结果表明P>0.05,表明2种方法计算结果无显著性差异。

表12 金花清感颗粒6种成分含量测定结果

3 讨论

3.1 指标成分及内参物的选择 根据处方组成,通过查阅药典及文献,本文对金花清感颗粒中可能含有的成分的麻黄碱、苦杏仁苷、绿原酸、木犀草苷、芒果苷、连翘酯苷A、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、贝母素甲、贝母素乙、甘草苷及甘草酸铵等成分进行了考查和筛选。根据各指标的峰型、分离度、响应值及在样品中的含量等为评价指标,最终选择了其中含量和响应值均较高且具有一定代表性的6个指标成分进行后续测定。其中,黄芩苷在6各成分中含量最高,出峰时间位于色谱图中位,在谱图中最易识别,且黄芩苷稳定易得,故选择黄芩苷为内参物。

3.2 色谱条件的优化 本文考查了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同洗脱系统,当流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液时,各峰峰形、分离度以及色谱图基线平稳情况均较好。紫外扫描发现6种成分的吸收波长存在较大差异,单一波长下难以同时检测。故采用254 nm(检测芒果苷、甘草酸铵)、277 nm(检测黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷)和327 nm(检测绿原酸)3个波长进行检测。

3.3 供试品溶液的制备方法考查 比较了不同提取方式(超声和回流)、不同溶剂(乙醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和甲醇)、不同提取时间(10、20、30、40和60 min)以及溶剂量(10、20、30、40和50 ml)对色谱峰响应值的影响,最终确定了供试品溶液的制备方法。

综上所述,本文建立了一测多评法同时测定金花清感颗粒中6种成分绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷和甘草酸铵的含量,与外标法所测结果无明显差异,该方法简便、重复性好,可为金花清感颗粒的质量控制提供参考,同时可降低多组分质量控制的检测成本。

1北京市中医管理局.北京中医药科学防治甲型H1N1流感—“金花清感方”新药研发纪实[J].北京中医药,2009,28(12):981.

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